Dilution du sperme dialysé et cryoconservé après décongélation et fertilité des reines d’abeilles mellifères
Préface
La cryoconservation du sperme des faux-bourdons de l’abeille mellifère (Apis mellifera) reste difficile. Malgré des décennies de recherche, le maintien de la viabilité et de la fonction des spermatozoïdes après décongélation limite encore l’utilisation pratique du sperme congelé.
L’étude a examiné les effets de la dilution du sperme cryoconservé avec la Bee Semen Solution (BSS) après décongélation sur la viabilité des spermatozoïdes et les performances reproductives des reines. Les reines ont été inséminées par voie instrumentale avec du sperme frais ou cryoconservé, dilué ou non dans les deux cas. Les chercheurs ont mesuré le nombre et la qualité des spermatozoïdes dans la spermathèque et évalué le couvain.
Par rapport au sperme frais, la cryoconservation a réduit la viabilité des spermatozoïdes et la fertilité des reines. La dilution avec la BSS après décongélation a montré une tendance à l’amélioration des paramètres spermatiques dans la spermathèque et de la fertilité. Les résultats suggèrent que le traitement après décongélation, dont le choix du diluant, pourrait améliorer l’issue de l’insémination avec du sperme cryoconservé selon un protocole comportant une dialyse. Les auteurs proposent aussi d’étudier si des inséminations répétées permettent d’augmenter le nombre de spermatozoïdes stockés et la fertilité des reines.
Introduction
La cryoconservation et le stockage du sperme des faux-bourdons restent des défis pour l’insémination instrumentale, l’élevage et la recherche. Malgré les travaux sur les protocoles de conservation (Melnichenko et Vavilov, 1975 ; Harbo, 1977 ; Kaftanoglu et Peng, 1984 ; Hopkins et al., 2012 ; Wegener et al., 2014a ; Alçay et al., 2019), aucune méthode largement adoptée ne préserve encore le pouvoir fécondant du sperme pendant un stockage prolongé (Cobey, 2016 ; Smilga-Spalvina et al., 2023). Les difficultés concernent la congélation, le stockage et l’insémination avec des échantillons décongelés. La congélation et la décongélation peuvent accroître les anomalies morphologiques, notamment les déformations de la tête et les flagelles tordus (Yániz et al., 2024), et réduire la motilité et la viabilité des spermatozoïdes (Hopkins et Herr, 2010 ; Özkök et Selcuk, 2020).
Plusieurs études ont porté sur les diluants employés avant la cryoconservation et leurs effets sur le sperme (Harbo, 1979 ; Taylor et al., 2009 ; Hopkins et Herr, 2010 ; Wegener et al., 2012 ; Alçay et al., 2019, 2022 ; Gulov et Laskin, 2021 ; Aktar et al., 2024 ; Nur et al., 2024 ; Mohammadi et al., 2025). Certains cryoprotecteurs courants peuvent être toxiques pour les spermatozoïdes, les reines ou les deux (Hopkins et Herr, 2010 ; Wegener et Bienefeld, 2012 ; Wegener et al., 2012). Diluer ou retirer une grande partie du cryoprotecteur après décongélation pourrait réduire sa toxicité (Wegener et al., 2014a ; Gül et al., 2017 ; Auth et Hopkins, 2021). D’où l’intérêt de diluants qui stabilisent les membranes des spermatozoïdes après décongélation tout en limitant les dommages. Peu d’études ont examiné les effets de cette dilution sur la qualité des spermatozoïdes dans la spermathèque et la fertilité des reines.
Wegener et al. (2014a) ont dilué le sperme cryoconservé avec la BSS, puis l’ont centrifugé pour retirer le cryoprotecteur et reconcentrer les spermatozoïdes. La motilité dans la spermathèque et la fertilité des reines ont diminué, avec une proportion de 27 % de couvain d’ouvrières. Gül et al. (2017) ont lavé et centrifugé les échantillons avec un diluant, des solutions de glucose ou du plasma séminal frais de faux-bourdons. Ils n’ont observé aucune amélioration significative de la proportion de couvain d’ouvrières. Dans les deux études, la centrifugation après dilution a pu nuire à la fonction des spermatozoïdes et au succès de l’insémination (Cobey et al., 2013). Wegener et al. (2014a) ont rapporté une meilleure qualité des spermatozoïdes et une fertilité accrue après dilution douce dans la BSS et mélange manuel, sans centrifugation.
Seules trois reines ont fait l’objet de cette procédure. Le rapport d’un volume de sperme pour deux volumes de BSS différait du rapport de 1:1 couramment utilisé pour l’insémination des reines (Skowronek et al., 1995 ; Gerula et al., 2016 ; Kahya et Gençer, 2022). La présente étude a évalué comment la dilution dans la BSS, après décongélation de sperme dialysé avant congélation, influait sur la fertilité des reines ainsi que sur le nombre et la qualité des spermatozoïdes dans la spermathèque.
Matériel et méthodes (lire l’article complet)
Résultats
Dans les échantillons testés, la motilité a atteint 98 % pour le sperme frais et 62 % pour le sperme décongelé. La mortalité des reines n’a pas différé significativement entre les quatre traitements (tableau 1). Une simulation de Monte-Carlo a donné χ² = 1,14, ddl = 3 et p = 0,77. Les analyses non paramétriques ont mis en évidence des différences entre groupes pour les paramètres reproductifs et spermatiques étudiés. La proportion de couvain d’ouvrières différait entre groupes (Kruskal–Wallis H(3) = 28,13, p < 0,001).
Les reines inséminées avec du sperme cryoconservé (groupes 3 et 4) ont produit une proportion moindre de couvain d’ouvrières que celles ayant reçu du sperme frais (groupes 1 et 2) (tableau 1). La taille d’effet associée à la cryoconservation était importante (δ de Cliff = 0,94–1,00). La différence entre les deux groupes recevant du sperme frais n’était pas significative (p = 1,000). Dans les groupes cryoconservés, la dilution avec la BSS était associée à une amélioration estimée faible à modérée (δ = −0,35 pour le groupe 3 par rapport au groupe 4), sans différence statistiquement significative.
Le nombre de spermatozoïdes dans la spermathèque variait selon le traitement (p = 0,0005 selon l’article, tableau 2). Les reines inséminées avec du sperme cryoconservé avaient moins de spermatozoïdes que celles ayant reçu du sperme frais (p < 0,05, δ = 0,72–1,00). La dilution dans la BSS après décongélation était associée à une tendance à la hausse (δ = −0,30 pour le groupe 3 par rapport au groupe 4, p = 1,000, tableau S1). La motilité variait aussi selon le traitement (H(3) = 25,60, p < 0,001) et diminuait avec la cryoconservation (δ = 0,73–1,00). Elle était plus élevée après dilution dans la BSS qu’avec du sperme décongelé non dilué (δ = −0,52 pour le groupe 3 par rapport au groupe 4, p = 0,26). La viabilité variait également selon le traitement (H(3) = 23,70, p < 0,001).
La viabilité du sperme cryoconservé était sensiblement inférieure à celle du sperme frais (δ = 0,83–1,00). La différence estimée entre les deux groupes recevant du sperme décongelé était négligeable (δ = 0,03, p = 1,000, tableau S1).
Discussion
La cryoconservation a influé sur le nombre et la qualité des spermatozoïdes stockés dans la spermathèque, comme l’ont rapporté des études antérieures (Harbo, 1983 ; Kaftanoglu et Peng, 1984 ; Hopkins et al., 2012 ; Wegener et al., 2012, 2014a ; Gül et al., 2017 ; Paillard et al., 2017 ; Gulov et Laskin, 2020, 2021 ; Yániz et al., 2020 ; Nur et al., 2024 ; Egyptien et al., 2025 ; Mohammadi et al., 2025). Peu d’études ont mesuré la fertilité des reines inséminées avec du sperme cryoconservé. Leurs protocoles de congélation et leurs diluants, employés avant ou après congélation, diffèrent. En pratique, il faut déterminer si la reine produit suffisamment d’ouvrières pour permettre à la colonie de se développer (Bryła et Trzcińska, 2024) ou suffisamment d’œufs fécondés pour élever de nouvelles reines et préserver les lignées en sélection (Wegener et al., 2012).
Les reines inséminées avec du sperme cryoconservé peuvent pondre des œufs fécondés, mais les résultats varient. Les premiers essais d’insémination unique ont obtenu une ponte après administration de 3,3 µL ou d’un volume non précisé, avec de faibles proportions de couvain d’ouvrières (8–22 % et 47 %) et 0,1 à 0,2 million de spermatozoïdes dans la spermathèque (Harbo, 1983 ; Kaftanoglu et Peng, 1984). Les résultats variaient selon le diluant. Wegener et al. (2012) ont rapporté 0,7 à 1,3 million de spermatozoïdes dans la spermathèque après cryoconservation avec du diméthylsulfoxyde (DMSO), contre 2,4 à 3,6 millions avec du sperme frais. L’ajout de cryoprotecteur par dialyse a donné 49 à 79 % de couvain d’ouvrières. Une dilution douce après décongélation sans centrifugation a donné jusqu’à 65,8 % de couvain d’ouvrières et jusqu’à 1,8 million de spermatozoïdes dans la spermathèque (Wegener et al., 2014a).
Hopkins et al. (2012) ont montré que les reines inséminées avec 5 µL de sperme cryoconservé pouvaient produire une descendance fertile sur plusieurs générations. Le taux de fécondation atteignait 95 à 100 % dans les meilleurs cas, avec une moyenne de 50 % au départ et de 46 % à la première génération. Des études ultérieures ont modifié les protocoles de congélation et d’insémination pour améliorer la viabilité des spermatozoïdes après décongélation et la fertilité des reines. Gül et al. (2017) ont constaté que les reines inséminées une fois avec 5 µL de sperme décongelé, lavé dans du plasma séminal de faux-bourdons, produisaient une proportion de couvain d’ouvrières comparable à celle des témoins ayant reçu du sperme congelé (48 % et 47 % respectivement), avec 0,81 et 1,6 million de spermatozoïdes dans la spermathèque. L’amélioration n’était pas significative. D’autres diluants utilisés avant la congélation, dont des solutions à base de miel, ont donné des résultats plus prometteurs.
Gulov et Laskin (2020, 2021) ont rapporté que des reines inséminées une fois avec 8 à 12 µL de sperme cryoconservé produisaient 17 à 99 % de couvain d’ouvrières (moyenne 61 %) et stockaient en moyenne 1,98 million de spermatozoïdes dans la spermathèque. Nur et al. (2024) ont obtenu une ponte après une seule insémination de 8 à 10 µL avec des diluants sans cryoprotecteur, sans fournir de données sur le couvain ou les spermatozoïdes. Une dilution excessive a réduit le nombre de spermatozoïdes dans la spermathèque à 0,14–0,15 million, avec ou sans centrifugation (Paillard et al., 2017).
Avec une méthode de congélation simple sans antibiotique, Egyptien et al. (2025) ont obtenu des œufs fécondés chez une faible proportion de reines inséminées une fois avec 5 µL de sperme cryoconservé. Le procédé était donc réalisable, avec une efficacité limitée. Dans la présente étude, le couvain d’ouvrières atteignait 90 % au maximum (moyenne 66 %) avec le sperme décongelé non dilué et 95 % (moyenne 78 %) avec le sperme décongelé dilué. Le nombre moyen de spermatozoïdes dans la spermathèque était respectivement de 1,86 et 2,04 millions.
Ces études montrent que le sperme cryoconservé permet la fécondation et la production d’ouvrières. Les résultats dépendent du volume d’insémination, du traitement du sperme, dont la dilution et la centrifugation, et du choix du cryoprotecteur ou du diluant. Dans cette étude, les reines ont été inséminées deux fois, ce qui pourrait expliquer en partie les écarts de remplissage de la spermathèque avec les études antérieures. Woyke (1960), Mackensen (1964) et Bieńkowska et al. (2011) ont constaté que la répartition d’une dose en deux inséminations augmentait le nombre de spermatozoïdes dans la spermathèque par rapport à une seule insémination.
Bolten et Harbo (1982) ont également constaté qu’à volume total égal, deux inséminations avec de petites quantités de sperme décongelé dilué amenaient significativement plus de spermatozoïdes dans la spermathèque qu’une seule insémination. La seconde a apporté 68 à 77 % de spermatozoïdes de plus que la première. Gąbka (2021) n’a observé aucune différence dans le début de la ponte entre les reines inséminées avec différentes doses. Les inséminations répétées peuvent aussi augmenter le risque de contamination du sperme et d’infection de la reine (Gąbka, 2021 ; Smilga-Spalvina et al., 2023).
Les inséminations répétées méritent donc d’être étudiées comme moyen d’augmenter le nombre de spermatozoïdes qui
atteignent la spermathèque, surtout avec du sperme cryoconservé, puisque la congélation peut réduire leur viabilité et leur motilité et ainsi influer sur la reproduction des reines (Wegener et al., 2012 ; Yániz et al., 2024). La dilution dans un milieu adapté pourrait avoir influencé les résultats, bien que la dilution du sperme frais n’ait pas amélioré significativement les paramètres mesurés. Les essais antérieurs avec du sperme frais ont montré que la dilution avait peu d’effet sur l’issue de l’insémination (Mackensen, 1969 ; Skowronek et al., 1995 ; Lodesani et al., 2003 ; Gerula et al., 2016 ; Gąbka et Cobey, 2018 ; Kahya et Gençer, 2022). Quels que soient les diluants et rapports étudiés, ces travaux n’ont pas révélé de différence significative du nombre de spermatozoïdes stockés dans la spermathèque entre reines ayant reçu du sperme frais dilué ou non dilué.La dilution n’a pas non plus entraîné de différence statistiquement significative entre les deux groupes recevant du sperme cryoconservé. Les auteurs envisagent un effet plus important après une dialyse du sperme contre une solution cryoprotectrice hypertonique, comme dans cette étude. La dialyse retire de l’eau au sperme. La dilution après décongélation pourrait rétablir son osmolarité et sa viscosité. Cela pourrait expliquer les valeurs plus élevées observées avec le sperme décongelé dilué lors de la comparaison des moyennes, des médianes et des tailles d’effet (delta de Cliff). La tendance était particulièrement nette pour la motilité, le nombre de spermatozoïdes et la proportion de couvain d’ouvrières.
Le tréhalose, un composant de la BSS (Wegener et al., 2014a), est naturellement présent dans le liquide séminal des faux-bourdons (Blum et al., 1962). Des constituants de ce liquide, dont les protéines, les acides aminés et les sucres, peuvent contribuer à maintenir la viabilité des spermatozoïdes pendant le stockage (den Boer et al., 2009). Nur et al. (2020) ont rapporté que l’ajout de 0,1 ou de 0,05 M de tréhalose à un milieu de congélation contenant 12 % de DMSO améliorait la motilité et l’intégrité de la membrane plasmique des spermatozoïdes après décongélation. Tsvetkov et al. (2024) ont observé une motilité et des paramètres cinétiques supérieurs avec le tréhalose sans DMSO par rapport au DMSO ou au glycérol. La BSS contenant du tréhalose pourrait atténuer la perte de motilité et contribuer à préserver la fécondation.
De nombreux spermatozoïdes sont perdus ou perdent leur viabilité lors de leur passage par les oviductes jusqu’à la spermathèque. Après un accouplement naturel, environ 3 à 5 % seulement atteignent la spermathèque (Yániz et al., 2020). Une perte supplémentaire de spermatozoïdes mobiles après cryoconservation pourrait donc influer sur la fertilité. Paillard et al. (2017) ont rapporté un risque accru d’absence de ponte d’œufs fécondés lorsque moins de 0,5 million de spermatozoïdes atteignent la spermathèque. La dilution pourrait faciliter leur dispersion.
La dilution peut aussi réduire la viscosité du sperme (Tofilski, 2014 ; Bratu et Pătruică, 2021). Le sperme est épais, a tendance à s’agglutiner, surtout lorsqu’il provient de faux-bourdons plus âgés, et peut être difficile à aspirer avec un embout d’insémination étroit (Cobey et al., 2013 ; Czekońska et al., 2013 ; Bieńkowska et Panasiuk, 2006). La dilution pourrait faciliter l’administration du sperme et la migration ultérieure des spermatozoïdes dans l’appareil reproducteur de la reine.
D’autres études sur les diluants et les protocoles d’insémination sont nécessaires pour améliorer la fertilité des reines et rendre la cryoconservation du sperme utilisable en élevage apicole et en conservation génétique.
Publié en décembre 2025 · Journal of Apicultural Science · DOI 10.2478/JAS-2025-0013
Auteurs
Mikołaj Borański, Małgorzata Bieńkowska, Beata Panasiuk et Dariusz Gerula · The National Institute of Horticultural Research, Pologne
Jakob Wegener · GrüBie Ashiralieva&Wegener Gbr, Allemagne
Traduction italienne de Davide Simeone
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