Scoperta dei batteri associati ai tessuti riproduttivi e delle modalità di acquisizione del microbiota nelle api da miele maschi (droni)
- Davide Simeone
- 11 mar
- Tempo di lettura: 11 min
L'ape da miele occidentale (Apis mellifera) fornisce servizi di impollinazione in tutto il mondo, contribuendo a circa un terzo dell'approvvigionamento alimentare globale, ed è il terzo animale agricolo economicamente più importante al mondo, grazie al loro ruolo di impollinatori. I servizi di impollinazione delle api da miele e tutti le mansioni dell'alveare sono svolti da operaie, mentre il compito dei droni (i maschi di apis mellifera spp.) è quello di accoppiarsi e condividere la loro genetica con una regina vergine di un'altra colonia. La fitness dei droni è direttamente legata al successo della regina e alla sopravvivenza della colonia.
Negli ultimi 12 anni, gli apicoltori di tutto il mondo hanno registrato un aumento dei tassi di mortalità delle colonie, con rapporti negli Stati Uniti che mostrano perdite fino al 50,8% all'anno, la cui causa è ancora poco compresa. Questo fenomeno è diventato ampiamente noto come Colony Collapse Disorder (CCD) nel 2007. Sono state proposte diverse ragioni per il CCD, come agenti patogeni, parassiti, scarsa disponibilità nutrizionale, cambiamenti climatici e prodotti chimici agricoli, ma i problemi di salute della regina sono stati identificati come una delle principali cause di mortalità delle colonie.
Come insetti eusociali, le api da miele si affidano a una gerarchia sociale in cui una singola regina è l'unica unità riproduttiva responsabile della qualità e della quantità della popolazione della colonia. Storicamente, la durata della vita di una regina delle api da miele nella sua colonia originale era di 2-7 anni, ma ora le regine vengono sostituite più frequentemente, con circa il 50% delle colonie che sostituisce una regina ogni sei mesi; ogni volta che una regina viene sostituita triplica la possibilità di mortalità della colonia. Le operaie delle api da miele costituiscono il 90% o più della colonia e sono responsabili della valutazione della salute della regina e dello svolgimento di tutti i compiti della colonia, tra cui il foraggiamento, la manutenzione dell'alveare e la cura della regina, dei droni e delle operaie appena nate. Le operaie sostituiranno una regina per diversi motivi, tra cui l'eccesso di deposizione di uova non fecondate (droni) a causa della regina che esaurisce o contiene sperma di scarsa qualità.
Le api da miele maschi, o droni, costituiscono solo una piccola percentuale della popolazione della colonia (<10%) durante la primavera e l'estate, e la loro unica funzione è quella di accoppiarsi con le regine vergini di altre colonie. Sebbene i droni non svolgano un ruolo diretto nella loro colonia madre, la loro forma riproduttiva ha un grande impatto sul successo delle future regine e, quindi, sulle colonie. Nonostante l'importanza della salute dei droni e della fecondità per la salute delle colonie, i droni sono stati in gran parte poco studiati rispetto alle operaie e alle regine.
I droni si sviluppano per circa 24 giorni prima di emergere da adulti. Durante lo sviluppo, e fino al momento in cui emerge il drone, viene completato l'intero processo di spermatogenesi. All'emergenza dell'adulto, le vescicole seminali e le ghiandole mucose non sono completamente sviluppate e tutto lo sperma risiede nei testicoli (Fig. 1). Da sei a 12 giorni dopo l'emergenza lo sperma migra nelle vescicole seminali dove sarà ospitato fino a quando il drone non si accoppi. Una volta completata la migrazione dello sperma, il drone diventa riproduttivamente maturo e i testicoli non sono più funzionali e si trasformano in tessuto necrotico (Fig. 1).
Come tutte le regine degli imenotteri sociali, le regine delle api da miele si accoppiano presto nella vita attraverso uno o pochi voli nuziali. La dimensione della colonia e la longevità dipendono dalla quantità e dalla qualità dello sperma raccolto in questi voli nuziali. Di conseguenza, il fluido seminale deve sostenere alti livelli di sperma che possono mantenere la vitalità nel maschio (vescicole seminali), durante l'accoppiamento e successivamente nell'organo di stoccaggio (spermateca) della regina per tutta la sua vita, poiché non si accoppia di nuovo. Non è chiaro quali fattori influenzino l'idoneità riproduttiva del drone delle api da miele, ma è noto che il loro numero di spermatozoi è altamente variabile.
È stato dimostrato che il microbiota intestinale svolge un ruolo importante nella salute delle operaie delle api da miele. Ad esempio, numerosi studi hanno dimostrato che il microbiota intestinale ha un impatto sull'immunità, sulla difesa dagli agenti patogeni, sul metabolismo e sul potenziale comportamento e sviluppo nelle operaie delle api da miele. Il microbiota intestinale delle operaie è stato ampiamente studiato a causa della loro grande dimensione della popolazione nella colonia. È stato dimostrato che il microbiota dell’operaia viene acquisito attraverso le interazioni sociali e l'esposizione ai materiali dell'alveare. In condizioni normali, si ritiene che il microbiota dell’operaia sia completamente stabilito entro 5 giorni dall'emergenza e rimanga relativamente stabile per tutta la vita di un'ape sana. Le api operaie possiedono un microbiota intestinale abbastanza semplice e altamente conservato composto principalmente da cinque gruppi principali: Bifidobacterium, Snodgrassella, Gilliamella, Lactobacillus e Bombilactobacillus. Sebbene i gruppi principali presenti nel microbiota intestinale dell’operaia siano conservati tra gli individui, diversi studi hanno rivelato che la diversità a livello di ceppo (all'interno della diversità delle specie) varia tra gli individui, risultando in comunità con varie capacità funzionali.
È stato osservato che il microbiota intestinale del drone contiene alcuni degli stessi gruppi delle operaie, ma è complessivamente meno diversificato e molto più variabile tra gli individui. Tuttavia, per quanto ne sappiamo, le modalità di acquisizione del microbiota del drone, compreso il ruolo che le interazioni sociali svolgono nella corretta istituzione, non sono state studiate. Negli ultimi anni, i microbi sono stati scoperti nei tessuti riproduttivi di diversi animali, compresi gli insetti, dove è stato dimostrato che beneficiano della salute dell'ospite, dell'idoneità riproduttiva e del successo della prole. Ad esempio, in alcuni insetti, come le zanzare e le mosche dello tse-tse, i batteri presenti nei tessuti riproduttivi sono stati associati allo sviluppo dell'ospite e/o all'aumento dell'idoneità riproduttiva. La presenza di microbi negli organi riproduttivi delle api da miele non è stata studiata, ma i risultati in altri insetti supportano la possibilità della loro esistenza e il potenziale ruolo nella salute e nella fecondità delle api da miele.
Le api regine sono difficili da studiare a causa del loro ruolo indispensabile nella colonia e della limitata trattabilità sperimentale. Poiché la forma riproduttiva della regina e la durata della vita dipendono fortemente dai droni con cui si è accoppiata, i droni sono un buon candidato per indagare l'esistenza e l'importanza dei batteri nei tessuti riproduttivi delle api da miele.
In questo studio, miravamo a (1) determinare se i droni possiedono batteri nei loro tessuti riproduttivi, (2) identificare come il microbiota intestinale e riproduttivo viene acquisito nei droni e (3) caratterizzare come le comunità di microbiota cambiano durante la maturazione dei droni. A tal fine, abbiamo utilizzato il sequenziamento dell'amplicone 16S per identificare e caratterizzare i batteri nei tessuti riproduttivi e negli intestini dei droni convenzionali e manipolati sperimentalmente. Nel complesso, abbiamo rivelato, per la prima volta, che i droni hanno batteri nei loro organi riproduttivi. Inoltre, abbiamo osservato che le budella e i tessuti riproduttivi dei droni emersi in natura tenuti in un ambiente di laboratorio sterile senza interazione sociale raramente contenevano i gruppi associati alle api da miele presenti nei droni e nelle operaie allevati convenzionalmente (ad esempio, Snodgrassella, Bifidobacterium, Gilliamella, Lactobacillus e Bombilactobacillus). Nel complesso, concludiamo che le interazioni sociali con le ape operaie (ad esempio, i comportamenti di alimentazione e toelettatura) sono fondamentali per l'acquisizione e lo sviluppo dell'intestino dei droni e del microbiota riproduttivo. Inoltre, la scoperta di una comunità batterica conservata negli organi riproduttivi dei droni rende l'ape da miele un buon sistema modello candidato per capire come il microbiota del tessuto riproduttivo influenza la forma fisica dell’ospite.
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RISULTATI
Abbiamo rivelato che i droni delle api da miele possiedono un microbiota riproduttivo del tessuto. Questa è una scoperta fondamentale che potrebbe avere un impatto importante sulla nostra comprensione dell'idoneità riproduttiva dei droni. Abbiamo anche dimostrato che la corretta istituzione sia del microbiota intestinale che del microbiota del tessuto riproduttivo è altamente dipendente dalle interazioni sociali con le loro sorelle operaie, poiché i droni potevano emergere naturalmente dai telai contenenti materiale dell'alveare ma, tenuti in laboratorio senza l’interazione sociale con le operaie non possedessero un microbiota "normale". Inoltre, nel nostro esperimento, i droni che sono stati restituiti all'alveare avevano un contatto limitato con il materiale dell'alveare poiché erano tenuti in gabbie di affidamento (vedi Materiali e metodi), indicando che era il contatto sociale con le operaie che si prendevano cura di loro a promuovere la creazione del loro microbiota. Come riportato in precedenza, abbiamo scoperto che i droni hanno comunità microbiche intestinali meno diversificate rispetto alle operaie e sono principalmente dominati dalle specie di Lactobacillus. Ciò potrebbe essere dovuto al fatto che le api nutrici sono responsabili dell'alimentazione e della cura dei droni, e quando le risorse sono basse, le nutrici spesso trascurano i droni.
Ipotizziamo che la quantità di contatto sociale che un drone riceve durante e dopo l'emergenza detti quanto bene stabiliranno il loro microbiota. La dieta e/o lo stile di vita potrebbero anche spiegare le differenze tra la composizione del microbiota delle operaie e dei droni. Ad esempio, le operaie consumano molto più polline rispetto ai droni, e la dieta delle operaie delle api da miele cambia man mano che invecchiano e passano da nutrici a bottinatrici. Le api operaie trascorrono anche una quantità significativa di tempo fuori dall'alveare una volta diventate bottinatrici, mentre i droni lasciano la colonia solo per partecipare a voli legati all’accoppiamento.
Abbiamo trovato un numero sorprendentemente alto di batteri (basato sul numero di copie 16S) all'interno dell'intestino e dei tessuti riproduttivi dei droni mantenuti in laboratorio (NE-D0 e Lab-D5), anche se queste comunità non contenevano i tipici gruppi associati alle api da miele. Una spiegazione di questa scoperta potrebbe essere la mancanza di esposizione ai batteri nativi, che normalmente supererebbero i microbi ambientali e impedirebbero loro di "prendere il sopravvento". Nel normale ambiente dell'alveare, i droni sono aiutati a rimuovere l’opercolo di cera durante l'emergenza e vengono nutriti immediatamente dalle api nutrici, presumibilmente iniziando l'acquisizione del loro microbiota. Pertanto, immaginiamo che tutti o la maggior parte dei batteri presenti nei nostri droni allevati in laboratorio abbiano avuto origine da loro mentre emergono dalle loro cellule, che contengono per lo più microbi ambientali e sono composte da materiali vegetali.
È importante notare che gran parte dei campioni NE-D0 non è passata attraverso il sequenziamento, probabilmente a causa dell'assenza di batteri sia nel loro intestino e tessuti riproduttivi. Inoltre, durante il filtraggio della qualità, abbiamo identificato che oltre il 10% delle letture dalle viscere dei droni tenuti in laboratorio erano assegnati a mitocondri, cloroplasti o non erano assegnati, e per alcuni individui, queste letture rappresentavano oltre il 40% delle letture totali, suggerendo che erano presenti pochissimi batteri. Sia le letture del cloroplasto che quelle mitocondriali sono talvolta rilevate nelle indagini 16S dell'intestino delle api da miele, ma ad una quantità molto bassa (ad esempio, <1%) a causa della presenza del tessuto ospite e del materiale vegetale. Inoltre, abbiamo rilevato una percentuale anomala delle letture dell'amplicone 16S assegnate come mitocondri (o non assegnate) dai testicoli dei droni conservati in laboratorio, in particolare nei testicoli NE-D0. Nei droni immaturi, i testicoli sono pieni di sperma, e nelle api da miele, i mitocondri costituiscono la maggior parte del tratto centrale di sperma.
Pertanto, i numeri di copie 16S determinati dalla qPCR nei tessuti del drone conservati in laboratorio potrebbero essere stati sopravvalutati a causa dell'amplificazione off-target dei mitocondri e/o dei cloroplasti piuttosto che dell'effettiva amplificazione delle copie batteriche 16S. Infatti, dopo aver completato questo studio, ci siamo resi conto che i primer 16S che abbiamo usato per qPCR sono particolarmente inclini all'amplificazione off-target dei mitocondri, specialmente in campioni con pochi batteri. Sebbene le comunità batteriche dell'intestino e dei tessuti riproduttivi fossero simili tra i droni Hive-D5 e Hive-D18 (ad esempio, entrambi prevalentemente composti da Lactobacillus), abbiamo osservato alcune differenze nell'abbondanza assoluta di batteri e nell'abbondanza relativa dei gruppi, il che può indicare che il microbiota riproduttivo e intestinale si sposta man mano che il drone matura. È importante notare che non abbiamo quantificato l'abbondanza assoluta di ciascuna specie chiave nel nostro studio; pertanto, non possiamo concludere che i cambiamenti che abbiamo osservato in base all'abbondanza relativa riflettano l'abbondanza effettiva di queste specie.
Inoltre, in questo studio, i droni NE-D0, Lab-D5 e Hive-D5 sono stati campionati alla fine dell'estate del 2021 e i droni Hive-D18 sono stati campionati nella primavera del 2022 da una colonia diversa. La differenza nella strategia di campionamento era dovuta al fatto che nell'estate del 2021 le operaie hanno completamente smesso di prendersi cura dei droni, quindi sono morti prima di raggiungere la maturità. Pertanto, abbiamo dovuto ottenere e analizzare droni maturi nella primavera successiva. Sebbene sia stato dimostrato che l'origine della colonia ha scarso impatto sulla composizione del microbiota intestinale delle operaie, uno studio precedente ha dimostrato che la stagione può influenzare l'abbondanza e la composizione assoluta dei batteri nell'intestino delle operaie. In particolare, è stato dimostrato che le api operaie invernali possiedono una maggiore abbondanza assoluta di batteri e una minore diversità alfa della comunità. Pertanto, è possibile che le differenze osservate tra i nostri droni Hive-D5 e Hive-D18 possano essere dovute a differenze stagionali. Tuttavia, abbiamo osservato carichi batterici più elevati nei droni Hive-D18 che sono stati campionati in primavera rispetto ai droni Hive-D5 che sono stati campionati a fine estate. Inoltre, non abbiamo trovato cambiamenti significativi nella diversità alfa nell'intestino o nei tessuti riproduttivi tra i droni Hive-D5 e Hive-D18 ed entrambi erano dominati dalle specie di Lactobacillus.
Sono necessari ulteriori studi per determinare se e come i cambiamenti stagionali, l'origine dell'alveare e altri fattori ambientali influiscono sul microbiota dei droni. Sebbene i gruppi trovati nell'intestino e negli organi riproduttivi dei droni fossero molto simili, i nostri metodi di sterilizzazione (incluso garantire che l'intestino non sia mai stato rotto) e l'elevata carica batterica rilevata nei tessuti riproduttivi suggeriscono che ciò non è dovuto alla contaminazione da parte del microbiota intestinale durante il campionamento. Strette somiglianze tra l'intestino e le comunità del microbiota dei tessuti riproduttivi sono state segnalate anche in altri insetti. Ad esempio, nella Fillominatrice di foglie di pomodoro (Tuta absoluta) e in alcune specie di zanzare, molti degli stessi gruppi batterici sono stati osservati sia nel microbiota intestinale che nel microbiota del tessuto riproduttivo.
A differenza della maggior parte degli insetti, le api da miele hanno comunità intestinali co-evolute altamente specializzate, rendendo plausibile che alcuni dei gruppi batterici principali si siano evoluti per abitare specificamente una nicchia tessutale e che le comunità risultanti abbiano differenze funzionali e a livello di ceppo. Non è meccanicamente chiaro come i microbi colonizzino i tessuti riproduttivi. Data la somiglianza nella composizione tassonomica tra l'intestino e i tessuti riproduttivi all'interno dei singoli droni, ipotizziamo che il sistema immunitario e il rivestimento intestinale, che è semi-permeabile nelle api adulte, non siano completamente sviluppati quando le api emergono, consentendo ai batteri di colonizzare l'intestino e spostarsi in altri organi, come i tessuti riproduttivi. Tuttavia, sono necessari studi futuri che indagano sull'organizzazione della comunità (ad esempio, utilizzando la colorazione FISH/etichettatura fluorescente) e la diversità a livello di ceppo (ad esempio, tramite sequenziamento meta-genomico e coltura) per convalidare queste ipotesi.
Il microbiota intestinale delle api da miele da lavoro è stato ampiamente studiato e ha dimostrato di avere un impatto sulla salute delle operaie in vari modi. Ad esempio, i microbi intestinali svolgono ruoli indispensabili nel metabolismo, nella difesa e nell'immunità degli agenti patogeni e nello sviluppo potenzialmente corretto delle operaie. Sebbene l'impatto del microbiota intestinale sulla salute dei droni non sia stato studiato direttamente, a causa della sua somiglianza con quello delle operaie, si presume che svolga ruoli simili nei droni. Poiché questo è il primo studio, a nostra conoscenza, per identificare e caratterizzare il microbiota del tessuto riproduttivo dell'ape da miele, possiamo solo ipotizzare che, come in altri animali, potrebbe avere un impatto sulla salute e sulla fecondità del drone, il che, a sua volta, potrebbe avere un impatto sulla regina con cui si accoppia e, quindi, sul successo delle future colonie.
È necessario un lavoro futuro per caratterizzare la funzione dei batteri presenti nei tessuti riproduttivi, ma il nostro studio dimostra che i microbi associati al tessuto riproduttivo dovrebbero essere considerati quando si studia la salute e l'idoneità riproduttiva dei droni. Inoltre, oltre ad essere un ottimo sistema per affrontare questioni fondamentali sulle comunità microbiche intestinali, i nostri risultati suggeriscono che le api da miele potrebbero anche essere un buon sistema modello per la ricerca sul microbiota riproduttivo.
Published: December 19, 2024
Articolo completo: https://journals.asm.org/doi/10.1128/msphere.00705-24
Author: Alexis Burks (Department of Biology, University of North Carolina, Greensboro, North Carolina, USA) Patrick Gallagher (Department of Plant and Microbial Biology, North Carolina State University, Raleigh, North Carolina, USA) Kasie Raymann (Department of Biology, University of North Carolina, Greensboro, North Carolina, USA) + (Department of Plant and Microbial Biology, North Carolina State University, Raleigh, North Carolina, USA)
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