Impatto del fungicida tebuconazolo sulla qualità dello sperma dei fuchi

La sopravvivenza della specie è assicurata da un "buon accoppiamento" tra l'individuo femmile e quello maschile, intendendo per "buon accoppiamento" non il mero atto ma la qualità delle componenti genetiche interessate. Nelle api da miele una di queste è il seme, lo sperma, dei fuchi. Un seme di scarso valore vitale mette in pericolo la sopravvivenza stessa delle specie di api mellifere, prim'ancora di riuscire a fare discorsi di sottospecie e selezione delle stesse, che negli ultimi anni influenzano il settore apistico. È di primaria importanza conoscere quali sono le minacce per la specie e comprendere che senza fuchi non vi sono api regine, senza fuchi non v'è apicoltura.

Raccolta di sperma di fuchi

Le api da miele sono colpite dal declino degli habitat naturali e dagli aspetti negativi della produzione agricola moderna, ed è ormai risaputo che la perdita di api da miele e alveari stanno aumentando in tutto il mondo. La maggior parte dei fattori che contribuiscono includono il cambiamento delle condizioni stagionali, le malattie delle api, le cattive pratiche di allevamento e i pesticidi chimici (Gregorc, 2020). Tra questi fattori, l'impatto dell'applicazione di pesticidi agricoli sulle api da miele sta attirando sempre più attenzione. Le api da miele assicurano l'impollinazione nei frutteti (Halder et al., 2019). Quindi, i campi agricoli sono luoghi importanti per gli apicoltori per posizionare i loro alveari. Tuttavia, i tempi inappropriati e l'uso eccessivo di pesticidi portano alla mortalità delle api da miele e all'interruzione della biodiversità. In particolare, l'uso di pesticidi durante la stagione della fioritura nei frutteti rappresenta una potenziale minaccia per le api da miele (Uhl & Brühl, 2019).

Il Tebuconazolo (TEB) ((RS)-1-p-clorofenil-4,4- dimetil-3-1(1H-1,2,4-triazol-1-il-metil) pentan-3-ol) è un fungicida e inibisce efficacemente la biosintesi dell'ergosterolo nei funghi, fornendo il controllo contro gli agenti patogeni fungini del suolo e fogliari (Ito et al., 2013). Tuttavia, studi precedenti hanno riportato vari effetti dannosi di TEB sui tessuti corporei, compresi gli organi riproduttivi e/o le cellule. Ad esempio, uno studio condotto con linee cellulari di trofoblasti placentari umani ha rivelato che TEB alla concentrazione di 10 µm ha diminuito la proliferazione cellulare, aumentato l'apoptosi, ridotto la migrazione cellulare e abbassato i livelli di mRNA intracellulare interrompendo la funzione di proteasi, ormoni, fattori angiogeni, fattori di crescita ed espansione delle citochine (Zhou et al., 2016). È stato dimostrato che 0,1 µm TEB ha inibito i livelli di testosterone ed estrogeni nel tessuto ovarico di criceto (Kjærstad et al., 2010), e 10 µm TEB ha inibito la sintesi del progesterone delle cellule luteali bovine (Atmaca et al., 2018). Mentre è stato segnalato che 1 µm TEB aumenta la secrezione di testosterone nelle cellule testicolari del toro riducendo al contempo la vitalità degli spermatozoi (Kabakci et al., 2021).

Fungicida sistemico triazolico di Syngenta per il melo, pero, pesco, vite, tabacco, ecc..

Sebbene il TEB sia classificato come leggermente pericoloso dall'Organizzazione Mondiale della Sanità, è stato ritirato dal mercato in alcuni paesi europei (EUR-Lex, 2009) in coppia con i suoi effetti di interruzione endocrina (TEDX, 2017). In questo contesto, la concentrazione di 1700 mg/kg determinata nei ratti come LD50 suggerisce una bassa tossicità per i mammiferi (Autorità, 2015). Per le api da miele, questa concentrazione è stata di 2770 mg/L e 1840 mg/L rispettivamente per 2 e 4 giorni di esposizione. Tuttavia, gli autori hanno rivelato che le concentrazioni di LD50 diluite di 20-30 volte di TEB hanno ridotto gli enzimi legati alla biochimica, alla digestione e alla disintossicazione e hanno influenzato negativamente i geni relativi alla risposta immunitaria, alla crescita o all'apoptosi nelle api da miele (Cang et al., 2023).

Numerosi studi hanno dimostrato la presenza di residui di TEB su piante e frutti. Il fatto che questo pesticida possa essere utilizzato durante il periodo di fioritura di alberi come mele, pere, ciliegie e pesche, che servono come fonti di nettare e polline per le api da miele, indica una potenziale minaccia (Fang et al., 2020; Li et al., 2020; Lucini & Molinari, 2009; Mohapatra, 2015; Szarka & Ramanarayanan, 2021). È stato precedentemente riferito che le api da miele che atterrano sui fiori di alberi trattati con pesticidi per raccogliere nettare possono portare direttamente a tossicità acuta o mortalità larvale (Fine et al., 2017; Yoder et al., 2017). Johnson et al. (2010) hanno rilevato elevate quantità di residui di TEB nelle api da miele mentre basse quantità di residui di TEB sono state rilevate nel polline e nel miele (Johnson et al., 2010).

La qualità dello sperma dei fuchi è un fattore critico nella riproduzione. La motilità del seme (MOT) è un criterio essenziale ampiamente utilizzato per valutare la capacità di fecondazione. Dopo l'accoppiamento, gli spermatozoi vengono inizialmente immagazzinati nell'ovidotto dell'ape regina. Dopo 72 ore migrano per circa 40 ore per raggiungere la spermateca della regina. Gli embrioni di ape operaie vengono fecondati quando la cellula uovo dell'ape regina viene fecondata dagli spermatozoi della spermateca. La motilità dello sperma svolge un ruolo cruciale sia nello stoccaggio dello sperma nella spermateca che nella fecondazione della cellula uovo durante l'oviposizione dell'ape regina (Cobey et al., 2013). L'integrità della membrana plasmatica (PMI) e il potenziale della membrana mitocondriale (MMP) sono un altro criterio importante per la qualità dello sperma. Il primo fornisce informazioni sulla vitalità cellulare basate sulla permeabilità selettiva della membrana cellulare mentre il secondo fornisce informazioni sui mitocondri, la sintesi di ATP nelle cellule (Kaya & Uysal, 2023). Se lo sperma dei fuchi è di scarsa qualità, danneggerà la continuità della colonia di api da miele.

Uno dei fattori che influenzano i parametri spermatologici sono gli inquinanti ambientali. Sebbene gli effetti negativi della TEB sul sistema riproduttivo di vari animali e esseri umani sia noto, le conseguenze sulla qualità dello sperma dei fuchi sono ancora sconosciuti (Kabakci et al., 2021; Taxvig et al., 2007; Yan et al., 2023; Zhou et al., 2016). Pertanto, questo lavoro ha studiato gli impatti di TEB, un fungicida triazolo, sui parametri spermatologici, tra cui MOT, PMI e MMP dei fuchi in modo dipendente dalla dose e dal tempo in condizioni in vitro.

I fuchi utilizzati in questo studio sono stati ottenuti dal Centro di ricerca sull'apicoltura dell'Università di Kırıkkale, e lo sperma è stato raccolto durante maggio e giugno. Questo periodo è stato preferito perché ha la più alta popolazione stagionale di fuchi maturi in questa regione con un clima continentale. Abbiamo usato sei diverse colonie con regine della stessa età e forza simile per tutti gli esperimenti raccogliendo un totale di 100 µl di sperma utilizzando uno strumento di inseminazione artificiale (Schley, Germania). Lo sperma è stato esposto a questi TEB per 24 ore in un incubatrice a 33 °C. Il seme è stato analizzato prima e dopo il periodo di incubazione, di 24 ore, in termini di parametri spermatologici (Cobey et al., 2013). Tutti i progetti sperimentali sono stati ripetuti almeno 6 volte.

Membrana plasmatica del seme di fuco

Dopo 24 ore di incubazione, la più alta concentrazione di TEB (1000 µm) ha ridotto significativamente (p<0,05) MOT, PMI e MMP di spermatozoi rispetto ad altre concentrazioni (Figura 4). I risultati di questo studio hanno rivelato che TEB ha un impatto negativo sullo sperma dei fuchi in modo dipendente dalla dose e dal tempo. I nostri risultati hanno indicato che una dose di 1000 µm ha influenzato negativamente il MOT e il PMI dello sperma a 0 ore (Figura 1) e anche il MMP è stato influenzato negativamente dopo 24 ore di incubazione (Figura 2).

Vitalità della membrana mitocondriale del seme di fuco

Altri studi hanno evidenziato gli effetti dei fungicidi del triazolo, tra cui TEB, sulla riproduzione in varie specie in condizioni sia in vitro che in vivo. Ad esempio, uno studio su 74 cellule testiculari bovine e sperma ha rivelato che 1 µm TEB ha aumentato la produzione di testosterone da parte delle cellule Leydig ma ha ridotto la vitalità del seme (Kabakci et al., 2021). Lo studio indica che lo sperma di toro è influenzato negativamente anche a basse dosi di esposizione a TEB, mentre gli effetti negativi sullo sperma dei fuchi sono stati osservati solo a dosi elevate. Questa differenza può essere attribuita alle differenze strutturali e di durata della vita tra gli spermatozoi dei mammiferi e degli insetti. La capacità dello sperma dei fuchi di mantenere la vitalità per un periodo più lungo a temperatura ambiente (circa 6 settimane) rispetto allo sperma di toro (circa 2-3 giorni) supporta questa idea (Burley et al., 2008; De Pauw et al., 2003). Nelle ratte gravide, la somministrazione orale di TEB ha portato a un aumento delle caratteristiche femminili nella prole maschile e alterazioni nella produzione di testosterone e progesterone (Taxvig et al., 2007). In uno studio che indaga sugli effetti dell'esposizione al TEB sul pesce zebra, è stato stabilito che la TEB ha influenzato negativamente lo sviluppo del testicolo e diminuito la motilità dello sperma (Yan et al., 2023).

Tuttavia, le api da miele nell'ambiente naturale possono essere esposte a vari pesticidi, tra cui TEB, e ci sono studi altamente limitati sugli effetti dei pesticidi sulle colonie di api da miele e sulle prestazioni riproduttive. In uno studio condotto con fuchi, la somministrazione orale di 200 ppb di imidacloprid ha ridotto la motilità dello sperma e ha colpito la MMP ma non ha modificato il PMI (Ciereszko et al., 2017). In un altro studio, diversi residui di pesticidi (amitraz, fluvalinate, coumaphos) nella cera d'api, che viene utilizzata per allevare api da miele, hanno portato a una riduzione del 5-20% della vitalità dello sperma nei fuchi (Fisher & Rangel, 2018). Kairo et al. (2016) hanno mostrato che l'esposizione al fipronil ha portato a livelli più bassi di PMI e ATP negli spermatozoi dei fuchi rispetto al controllo (Kairo et al., 2016). Allo stesso modo, il trattamento con Neonicotinoidi nei fuchi ha portato a un PMI degli spermatozoi inferiore del 20% rispetto a quello del gruppo di controllo (Straub et al., 2021).

È stata condotta una ricerca limitata sull'impatto dei pesticidi sugli attributi spermatologici in vitro dei fuchi, sebbene i pochi studi precedenti abbiamo segnalato che i pesticidi selezionati hanno modificato significativamente il contenuto di MOT, PMI e/o ATP degli spermatozoi dei fuchi (Abdelkader et al., 2015; Inouri-Iskounen et al., 2020).

Fungicida triazolico di BASF ad ampio spettro

Questa è la prima ricerca che indaga l'effetto del fungicida del tebuconazolo sui parametri spermatologici del seme dei fuchi in vitro. I nostri risultati forniscono prove degli effetti negativi della TEB sulla qualità dello sperma dei fuchi. Come si vede nei nostri risultati, a differenza di basse dosi tra 0-100 µm, la più alta concentrazione di TEB a 1000 µm ha ridotto MOT, PMI e MMP (a sole 24 ore). La motilità dello sperma è il parametro chiave della qualità riproduttiva. Questo parametro ha mostrato una diminuzione in entrambi i periodi di incubazione nel gruppo contenente 1000 µm TEB. L'interruzione dell'integrità della membrana plasmatica porta a danni cellulari e a una ridotta motilità dello sperma. Numerosi studi hanno dimostrato una correlazione tra motilità e PMI (Ahmad et al., 2014; Fraser et al., 2001; Varisli et al., 2009). Gli spermatozoi richiedono energia continua per il loro movimento. La trasformazione dell'ATP è il principale processo di produzione di energia per fornire motilità dello sperma (Abdelkader et al., 2015). Questa energia necessaria è fornita dai mitocondri nelle cellule. I nostri risultati hanno rivelato che MMP è diminuito significativamente dopo l'esposizione di 1000 µm TEB per 24 ore. Questo può essere un altro motivo della riduzione della motilità dello sperma osservata alla fine del periodo di esposizione. L'integrità della membrana plasmatica viene solitamente misurata per valutare la vitalità negli spermatozoi dei droni (Kaya & Uysal, 2023). Abbiamo anche scoperto che l'esposizione in vitro di 1000 µm TEB allo sperma di fuchi riduceva il PMI. Questo può essere associato al fatto che la membrana cellulare è il bersaglio del TEB. Era ben definito che il TEB inibisce l'enzima P450 sulla membrana cellulare dei funghi, influenzando così la loro integrità (Ito et al., 2013). In conformità con questo Hajer et al. (2020) hanno riferito che TEB ha inibito le attività testicolare di P450 e glutatione S-transferasi e ha ridotto il numero di spermatozoi causa di epididimite nei ratti (Hajer et al., 2020). Allo stesso modo, il trattamento TEB in vivo nei ratti (Hajer et al., 2020) e nel pollo (Serra et al., 2023) ha aumentato le anomalie degli spermatozoi diminuendo la motilità, la velocità, i conteggi e/o la vitalità.

Un altro motivo di PMI ridotto negli spermatozoi può essere l'aumento dello stress ossidativo correlato al TEB poiché è stato precedentemente segnalato che TEB causa la perossidazione lipidica, l'ossidazione delle proteine e grave degradazione del DNA negli organi riproduttivi maschili (Hajer et al., 2020). D'altra parte, l'MMP è un parametro vitale per valutare la funzione dei mitocondri. Studi precedenti hanno dimostrato che i pesticidi ambientali possono influenzare i livelli di ATP degli spermatozoi (Abdelkader et al., 2015; Kairo et al., 2016). Allo stesso modo, abbiamo osservato che 1000 µm TEB hanno ridotto i livelli di MMP degli spermatozoi a 24 ore, e possibili alterazioni subletali nella qualità dello sperma non possono essere escluse a causa del potenziale bioaccumulo di TEB e degli effetti cumulativi delle sue basse concentrazioni.

È ben noto che i residui fungicidi, tra cui TEB, contaminano l'ambiente, così come le api da miele e i loro prodotti. Anche a basse concentrazioni, la loro esposizione a lungo termine può causare interruzioni endocrine, metaboliche o sistemiche in organismi cellulari, mitocondriali e/o come pesci, insetti, api, piante, mammiferi e/o esseri umani (Johnson et al., 2010).

Conclusione: Questo studio ha esaminato i possibili effetti in vitro di TEB, un fungicida triazolo, sulla qualità dello sperma di fuchi. Considerando l'importanza della vitalità e della motilità dello sperma dipendenti dall'integrità della membrana plasmatica e dall'attività mitocondriale sulla salute riproduttiva, gli effetti negativi della TEB sulla qualità dello sperma dei fuchi possono finalmente avere un riscontro sulla riproduzione delle api da miele e sulla produzione di prodotti delle api da miele.

Abdulkadir KAYA (Department of Reproduction and Artificial Insemination, Faculty of Veterinary Medicine, Kırıkkale University, Kırıkkale, Türkiye; Ankara University, Institute of Health Sciences, Ankara, Türkiye) and Ruhi KABAKÇI (Department of Physiology, Faculty of Veterinary Medicine, Kırıkkale University, Kırıkkale, Türkiye)

Turkish Veterinary Journal, 6(2): 71-77, 2024 - DOI: 10.51755/turkvetj.1577784