Dialysoidun ja kryosäilytetyn siemennesteen laimentaminen sulatuksen jälkeen ja mehiläiskuningattarien hedelmällisyys
Esipuhe
Tarhamehiläisen (Apis mellifera) kuhnurien siemennesteen kryosäilytys on edelleen haastavaa. Vuosikymmenten tutkimuksesta huolimatta siittiöiden elinkyvyn ja toiminnan säilyttäminen sulatuksen jälkeen rajoittaa pakastetun siemennesteen käyttöä.
Tutkimuksessa selvitettiin, miten kryosäilytetyn kuhnurin siemennesteen laimentaminen Bee Semen Solution -liuoksella (BSS) sulatuksen jälkeen vaikuttaa siittiöiden elinkykyyn ja kuningattarien lisääntymiseen. Kuningattaret keinosiemennettiin tuoreella tai kryosäilytetyllä siemennesteellä. Kummassakin tapauksessa käytettiin sekä laimentamatonta että laimennettua siemennestettä. Tutkijat mittasivat siittiösäiliön siittiöiden määrän ja laadun sekä arvioivat sikiöalan koostumusta.
Kryosäilytys heikensi siittiöiden elinkykyä ja kuningatarten hedelmällisyyttä tuoreeseen siemennesteeseen verrattuna. Sulatuksen jälkeinen BSS-laimennus näytti parantavan siittiösäiliöstä mitattuja arvoja ja hedelmällisyyttä. Tulokset viittaavat siihen, että sulatuksen jälkeinen käsittely ja laimentimen valinta voivat vaikuttaa keinosiemennyksen tuloksiin, kun siemenneste kryosäilytetään dialyysiä hyödyntävällä menetelmällä. Kirjoittajat ehdottavat lisäksi selvitettäväksi, voidaanko toistuvilla siemennyksillä lisätä siittiöiden määrää siittiösäiliössä ja parantaa kuningatarten hedelmällisyyttä.
Johdanto
Kuhnurin siemennesteen kryosäilytys ja varastointi ovat edelleen haasteita mehiläisten keinosiemennyksessä, jalostuksessa ja tutkimuksessa. Tehokkaita menetelmiä on kehitetty vuosia (Melnichenko ja Vavilov, 1975; Harbo, 1977; Kaftanoglu ja Peng, 1984; Hopkins ym., 2012; Wegener ym., 2014a; Alçay ym., 2019), mutta laajasti käytettyä menetelmää, joka säilyttäisi siemennesteen hedelmöityskyvyn pitkäaikaissäilytyksessä, ei vielä ole (Cobey, 2016; Smilga-Spalvina ym., 2023). Haasteita liittyy näytteiden pakastamiseen, varastointiin ja kuningatarten onnistuneeseen siementämiseen sulatetulla siemennesteellä. Pakastus ja sulatus voivat lisätä siittiöiden rakennepoikkeavuuksia, kuten pään epämuodostumia ja hännän kiertymistä (Yániz ym., 2024), ja heikentää siittiöiden liikkuvuutta ja elinkykyä (Hopkins ja Herr, 2010; Özkök ja Selcuk, 2020).
Useissa tutkimuksissa on tarkasteltu ennen kryosäilytystä käytettäviä laimentimia ja niiden vaikutuksia siemennesteen laatuun (Harbo, 1979; Taylor ym., 2009; Hopkins ja Herr, 2010; Wegener ym., 2012; Alçay ym., 2019, 2022; Gulov ja Laskin, 2021; Aktar ym., 2024; Nur ym., 2024; Mohammadi ym., 2025). Osa tavallisista kylmäsuoja-aineista voi vahingoittaa siittiöitä, kuningattaria tai molempia (Hopkins ja Herr, 2010; Wegener ja Bienefeld, 2012; Wegener ym., 2012). Kylmäsuoja-aineen laimentaminen tai poistaminen suurelta osin sulatuksen jälkeen voi vähentää sen toksisuutta (Wegener ym., 2014a; Gül ym., 2017; Auth ja Hopkins, 2021). Siksi tutkitaan laimentimia, jotka vakauttavat siittiöiden solukalvoja ja vähentävät vaurioita sulatuksen jälkeen. Vain harvoissa tutkimuksissa on selvitetty, miten sulatuksen jälkeinen laimennus vaikuttaa siittiöiden laatuun siittiösäiliössä ja kuningatarten hedelmällisyyteen.
Wegener ym. (2014a) laimensivat kryosäilytettyä siemennestettä BSS-liuoksella ja sentrifugoivat sen poistaakseen kylmäsuoja-aineen ja väkevöidäkseen siittiöt uudelleen. Siittiöiden liikkuvuus siittiösäiliössä ja kuningatarten hedelmällisyys heikkenivät, ja työläissikiöiden osuus oli 27 %. Gül ym. (2017) pesivät ja sentrifugoivat näytteitä siemennesteen laimentimella, glukoosiliuoksilla tai kuhnurin tuoreella siemenplasmalla. Työläissikiöiden osuus ei kasvanut merkitsevästi. Molemmissa tutkimuksissa laimennuksen jälkeinen sentrifugointi saattoi heikentää siittiöiden toimintaa ja siemennyksen onnistumista (Cobey ym., 2013). Wegener ym. (2014a) raportoivat paremmasta siittiöiden laadusta ja hedelmällisyydestä, kun näytteet laimennettiin varovasti BSS-liuoksella ja sekoitettiin käsin ilman sentrifugointia.
Menetelmää kokeiltiin vain kolmella kuningattarella. Yhden siemennesteosan ja kahden BSS-osan suhde poikkesi kuningatarten siemennyksessä tavallisesta suhteesta 1:1 (Skowronek ym., 1995; Gerula ym., 2016; Kahya ja Gençer, 2022). Tässä tutkimuksessa selvitettiin, miten ennen pakastusta dialysoidun siemennesteen laimentaminen BSS-liuoksella sulatuksen jälkeen vaikuttaa kuningatarten hedelmällisyyteen sekä siittiöiden määrään ja laatuun siittiösäiliössä.
Aineisto ja menetelmät (lue koko artikkeli)
Tulokset
Tutkituissa näytteissä siittiöiden liikkuvuus oli tuoreessa siemennesteessä 98 % ja sulatetussa siemennesteessä 62 %. Kuningatarten kuolleisuus ei eronnut merkitsevästi neljän käsittelyn välillä (taulukko 1). Monte Carlo -simulaatio antoi tuloksen χ² = 1,14, df = 3 ja p = 0,77. Epäparametrisissa analyyseissä havaittiin eroja tutkituissa lisääntymis- ja siittiömuuttujissa. Työläissikiöiden osuus vaihteli ryhmien välillä (Kruskal–Wallis H(3) = 28,13, p < 0,001).
Kryosäilytetyllä siemennesteellä siemennetyt kuningattaret (ryhmät 3 ja 4) tuottivat suhteellisesti vähemmän työläissikiöitä kuin tuoreella siemennesteellä siemennetyt kuningattaret (ryhmät 1 ja 2) (taulukko 1). Kryosäilytyksen vaikutus oli suuri (Cliffin δ = 0,94–1,00). Tuoreen siemennesteen ryhmien välillä ei havaittu merkitsevää eroa (p = 1,000). Kryosäilytetyissä ryhmissä BSS-laimennukseen liittyi pieni tai kohtalainen arvioitu parannus (δ = −0,35, kun ryhmää 3 verrattiin ryhmään 4), mutta ero ei ollut tilastollisesti merkitsevä.
Siittiöiden määrä siittiösäiliössä vaihteli käsittelyittäin (artikkelissa ilmoitettu p = 0,0005, taulukko 2). Kryosäilytetyllä siemennesteellä siemennettyjen kuningatarten siittiösäiliössä oli vähemmän siittiöitä kuin tuoreella siemennesteellä siemennetyillä (p < 0,05, δ = 0,72–1,00). Sulatuksen jälkeisessä BSS-laimennuksessa siittiömäärät olivat yleensä suurempia (δ = −0,30, kun ryhmää 3 verrattiin ryhmään 4, p = 1,000, taulukko S1). Myös liikkuvuus vaihteli käsittelyittäin (H(3) = 25,60, p < 0,001) ja heikkeni kryosäilytyksessä (δ = 0,73–1,00). Liikkuvuus oli BSS-laimennuksen jälkeen suurempi kuin laimentamattomassa sulatetussa ryhmässä (δ = −0,52, kun ryhmää 3 verrattiin ryhmään 4, p = 0,26). Myös elinkyky vaihteli käsittelyittäin (H(3) = 23,70, p < 0,001).
Kryosäilytetyn siemennesteen siittiöiden elinkyky oli selvästi heikompi kuin tuoreen (δ = 0,83–1,00). Sulatetun siemennesteen ryhmien arvioitu ero oli vähäinen (δ = 0,03, p = 1,000, taulukko S1).
Pohdinta
Kryosäilytys vaikutti siittiösäiliöön varastoituneiden siittiöiden määrään ja laatuun, kuten aiemmissakin tutkimuksissa on raportoitu (Harbo, 1983; Kaftanoglu ja Peng, 1984; Hopkins ym., 2012; Wegener ym., 2012, 2014a; Gül ym., 2017; Paillard ym., 2017; Gulov ja Laskin, 2020, 2021; Yániz ym., 2020; Nur ym., 2024; Egyptien ym., 2025; Mohammadi ym., 2025). Vain harvoissa tutkimuksissa on arvioitu kryosäilytetyllä siemennesteellä siemennettyjen kuningatarten hedelmällisyyttä. Tutkimukset eroavat toisistaan pakastusmenetelmien sekä ennen pakastusta tai sen jälkeen käytettyjen laimentimien osalta. Käytännössä ratkaisevaa on, tuottaako kuningatar riittävästi työläisiä yhdyskunnan kasvuun (Bryła ja Trzcińska, 2024) tai riittävästi hedelmöittyneitä munia uusien kuningatarten kasvattamiseen ja jalostuslinjojen säilyttämiseen (Wegener ym., 2012).
Kryosäilytetyllä siemennesteellä siemennetyt kuningattaret voivat munia hedelmöittyneitä munia, mutta tulokset vaihtelevat. Varhaisissa kertasiemennyskokeissa muninta onnistui 3,3 µL:n tai ilmoittamattoman annoksen jälkeen. Työläissikiöiden osuudet (8–22 % ja 47 %) ja siittiömäärät siittiösäiliössä (0,1–0,2 miljoonaa) jäivät pieniksi (Harbo, 1983; Kaftanoglu ja Peng, 1984). Laimentimien tulokset vaihtelivat. Dimetyylisulfoksidia (DMSO) käyttäneessä kryosäilytyksessä siittiömäärät olivat 0,7–1,3 miljoonaa, tuoreella siemennesteellä 2,4–3,6 miljoonaa (Wegener ym., 2012). Kylmäsuoja-aineen lisääminen dialyysillä tuotti 49–79 % työläissikiöitä. Varovainen laimennus sulatuksen jälkeen ilman sentrifugointia tuotti enimmillään 65,8 % työläissikiöitä ja 1,8 miljoonaa siittiötä siittiösäiliöön (Wegener ym., 2014a).
Hopkins ym. (2012) osoittivat, että 5 µL:lla kryosäilytettyä siemennestettä siemennetyt kuningattaret saattoivat tuottaa lisääntymiskykyisiä jälkeläisiä usean sukupolven ajan. Hedelmöittymisosuus oli parhaimmillaan 95–100 % ja keskimäärin aluksi 50 % ja ensimmäisessä jälkeläissukupolvessa 46 %. Myöhemmissä tutkimuksissa pakastus- ja siemennysmenetelmiä muutettiin, jotta siittiöiden elinkyky sulatuksen jälkeen ja kuningatarten hedelmällisyys paranisivat. Gül ym. (2017) havaitsivat, että kerran 5 µL:lla sulatettua, kuhnurin siemenplasmassa pestyä siemennestettä siemennetyt kuningattaret tuottivat suunnilleen saman osuuden työläissikiöitä kuin pakastettua vertailunäytettä saaneet (48 % ja 47 %). Siittiösäiliöissä oli vastaavasti 0,81 ja 1,6 miljoonaa siittiötä. Merkitsevää parannusta ei havaittu. Eräillä ennen pakastusta käytetyillä laimentimilla, kuten hunajapohjaisilla liuoksilla, saatiin lupaavampia tuloksia.
Gulov ja Laskin (2020, 2021) raportoivat, että kerran 8–12 µL:lla kryosäilytettyä siemennestettä siemennetyt kuningattaret tuottivat 17–99 % työläissikiöitä (keskiarvo 61 %) ja varastoivat siittiösäiliöön keskimäärin 1,98 miljoonaa siittiötä. Nur ym. (2024) saivat kuningattaret munimaan yhden 8–10 µL:n siemennyksen jälkeen laimentimilla, joissa ei ollut kylmäsuoja-ainetta. Sikiöistä ja siittiöistä ei raportoitu tietoja. Liiallinen laimentaminen pienensi siittiösäiliön siittiömäärän 0,14–0,15 miljoonaan sentrifugoinnista riippumatta (Paillard ym., 2017).
Egyptien ym. (2025) saivat yksinkertaisella antibiootittomalla pakastusmenetelmällä hedelmöittyneitä munia pieneltä osalta kerran 5 µL:lla kryosäilytettyä siemennestettä siemennetyistä kuningattarista. Menetelmä oli toteuttamiskelpoinen, mutta teholtaan rajallinen. Tässä tutkimuksessa työläissikiöiden osuus oli laimentamattomalla sulatetulla siemennesteellä enintään 90 % (keskiarvo 66 %) ja laimennetulla enintään 95 % (keskiarvo 78 %). Siittiösäiliössä oli keskimäärin 1,86 ja 2,04 miljoonaa siittiötä vastaavasti.
Tutkimukset osoittavat, että kryosäilytetyllä siemennesteellä voidaan saada aikaan hedelmöitys ja tuottaa työläisiä. Tulokset riippuvat siemennysannoksen tilavuudesta, siemennesteen käsittelystä, kuten laimentamisesta ja sentrifugoinnista, sekä kylmäsuoja-aineesta tai laimentimesta. Tässä tutkimuksessa kuningattaret siemennettiin kahdesti, mikä voi osittain selittää eroja aiempien tutkimusten siittiömääriin. Woyken (1960), Mackensenin (1964) ja Bieńkowskan ym. (2011) mukaan annoksen jakaminen kahteen siemennykseen lisäsi siittiösäiliön siittiömäärää yhteen siemennykseen verrattuna.
Bolten ja Harbo (1982) havaitsivat myös, että kaksi siemennystä pienillä määrillä laimennettua sulatettua siemennestettä toi siittiösäiliöön merkitsevästi enemmän siittiöitä kuin yksi siemennys samalla kokonaistilavuudella. Toisella kerralla siittiöitä päätyi säiliöön 68–77 % enemmän kuin ensimmäisellä. Gąbka (2021) ei havainnut eroa muninnan alkamisessa eri siemennesteannoksia saaneiden kuningatarten välillä. Toistuvat siemennykset voivat myös lisätä siemennesteen kontaminaation ja kuningattaren infektion riskiä (Gąbka, 2021; Smilga-Spalvina ym., 2023).
Toistuvia siemennyksiä kannattaa siis tutkia keinona lisätä niiden siittiöiden määrää, jotka
saavuttavat siittiösäiliön. Tämä koskee etenkin kryosäilytettyä siemennestettä, sillä pakastus voi heikentää siittiöiden elinkykyä ja liikkuvuutta ja siten vaikuttaa kuningattaren lisääntymiseen (Wegener ym., 2012; Yániz ym., 2024). Laimentaminen sopivaan väliaineeseen saattoi vaikuttaa tuloksiin, vaikka tuoreen siemennesteen laimennus ei parantanut tutkittuja muuttujia merkitsevästi. Aiemmissa tuoretta siemennestettä koskevissa kokeissa laimentamisella oli vain vähän vaikutusta siemennyksen onnistumiseen (Mackensen, 1969; Skowronek ym., 1995; Lodesani ym., 2003; Gerula ym., 2016; Gąbka ja Cobey, 2018; Kahya ja Gençer, 2022). Tutkituilla laimentimilla ja seossuhteilla ei havaittu merkitsevää eroa siittiösäiliöön varastoituneiden siittiöiden määrässä laimennettua tai laimentamatonta tuoretta siemennestettä saaneiden kuningatarten välillä.Myöskään kryosäilytetyn siemennesteen ryhmien erot eivät olleet tilastollisesti merkitseviä. Kirjoittajat pitävät voimakkaampaa vaikutusta mahdollisena, kun siemenneste on tämän kokeen tavoin dialysoitu hypertonista kylmäsuojaliuosta vasten. Dialyysi poistaa siemennesteestä vettä. Sulatuksen jälkeinen laimennus voi auttaa palauttamaan osmolaarisuuden ja viskositeetin. Tämä voi selittää laimennetulla sulatetulla siemennesteellä havaitut suuremmat arvot, kun verrattiin keskiarvoja, mediaaneja ja vaikutuskokoja (Cliffin delta). Suuntaus näkyi selvimmin siittiöiden liikkuvuudessa ja määrässä sekä työläissikiöiden osuudessa.
Trehaloosi on BSS-liuoksen ainesosa (Wegener ym., 2014a), jota esiintyy luontaisesti kuhnurien siemennesteessä (Blum ym., 1962). Siemennesteen proteiinit, aminohapot ja sokerit voivat auttaa säilyttämään siittiöiden elinkyvyn varastoinnin aikana (den Boer ym., 2009). Nur ym. (2020) raportoivat, että 0,1 tai 0,05 M:n trehaloosilisä 12 % DMSO:ta sisältävään pakastusliuokseen paransi siittiöiden liikkuvuutta ja solukalvon eheyttä sulatuksen jälkeen. Tsvetkov ym. (2024) havaitsivat, että trehaloosi ilman DMSO:ta säilytti liikkuvuuden ja liikeominaisuudet sulatuksessa paremmin kuin DMSO tai glyseroli. Trehaloosia sisältävä BSS voi osittain lieventää liikkuvuuden heikkenemistä ja siten tukea hedelmöitystä.
Monet siittiöt menetetään tai menettävät elinkykynsä kulkiessaan munanjohtimien kautta siittiösäiliöön. Luonnollisen parittelun jälkeen vain noin 3–5 % siittiöistä saavuttaa säiliön (Yániz ym., 2020). Kryosäilytyksen aiheuttama liikkuvien siittiöiden lisämenetys voi siksi vaikuttaa kuningattaren hedelmällisyyteen. Paillard ym. (2017) raportoivat, että hedelmöittyneiden munien puuttumisen riski kasvoi, jos siittiösäiliöön päätyi alle 0,5 miljoonaa siittiötä. Laimennus voi helpottaa siittiöiden leviämistä.
Laimennus voi myös vähentää siemennesteen viskositeettia (Tofilski, 2014; Bratu ja Pătruică, 2021). Siemenneste on sakeaa ja paakkuuntuu helposti, etenkin vanhemmilta kuhnureilta kerättynä. Sitä voi olla vaikea imeä kapeaan siemennyskärkeen (Cobey ym., 2013; Czekońska ym., 2013; Bieńkowska ja Panasiuk, 2006). Laimennus voi helpottaa siemennesteen annostelua ja siittiöiden myöhempää kulkeutumista kuningattaren lisääntymiselimistössä.
Laimentimien koostumusta ja siemennysmenetelmiä on tutkittava lisää, jotta kuningatarten hedelmällisyyttä voidaan parantaa ja siemennesteen kryosäilytyksestä saadaan käytännöllinen väline mehiläisjalostukseen ja geneettisen monimuotoisuuden säilyttämiseen.
Julkaistu joulukuussa 2025 · Journal of Apicultural Science · DOI 10.2478/JAS-2025-0013
Kirjoittajat
Mikołaj Borański, Małgorzata Bieńkowska, Beata Panasiuk ja Dariusz Gerula · The National Institute of Horticultural Research, Puola
Jakob Wegener · GrüBie Ashiralieva&Wegener Gbr, Saksa
Italiankielinen käännös Davide Simeone
Kommentit