Tebukonatsolin vaikutus kuhnurien siemennesteen laatuun
Lisääntymisen onnistuminen riippuu parittelun onnistumisesta. Tarhamehiläisillä yksi ratkaisevista tekijöistä on kuhnurien siemennesteen laatu. Siittiöiden heikko elinkyky voi haitata lisääntymistä, mikä on perustavanlaatuinen kysymys myös alalajeista ja niiden jalostuksesta keskusteltaessa. Tarhamehiläisiin kohdistuvien uhkien ymmärtäminen edellyttää kuhnurien merkityksen tunnistamista hedelmöityksessä ja mehiläisyhdyskuntien jatkuvuudessa.
Luonnollisten elinympäristöjen häviäminen ja eräät nykyaikaiset maatalouskäytännöt vaikuttavat tarhamehiläisiin. Mehiläisten ja yhdyskuntien menetyksiä raportoidaan eri puolilla maailmaa. Niihin vaikuttavat muun muassa vuodenaikaisolojen muutokset, mehiläistaudit, puutteelliset hoitokäytännöt ja kemialliset torjunta-aineet (Gregorc, 2020). Maatalouden torjunta-aineiden vaikutukset tarhamehiläisiin saavat yhä enemmän huomiota. Tarhamehiläiset pölyttävät hedelmätarhoja (Halder ym., 2019). Siksi viljelyalueet ovat mehiläistarhaajille tärkeitä pesien sijoituspaikkoja. Kuitenkin torjunta-aineiden liiallinen käyttö tai käyttö väärään aikaan voi tappaa mehiläisiä ja haitata luonnon monimuotoisuutta. Käsittely hedelmäpuiden kukinnan aikana on erityinen riski (Uhl & Brühl, 2019).
Tebukonatsoli (TEB), (RS)-1-(4-kloorifenyyli)-4,4-dimetyyli-3-(1,2,4-triatsol-1-yylimetyyli)pentan-3-oli, on sienitautien torjunta-aine, joka estää sienten ergosterolin biosynteesiä ja auttaa torjumaan maassa ja lehdillä esiintyviä sienitaudinaiheuttajia (Ito ym., 2013). Aiemmissa tutkimuksissa on kuitenkin raportoitu TEB:n haitallisista vaikutuksista eri kudoksiin, myös lisääntymiselimiin ja -soluihin. Ihmisen istukan trofoblastisolulinjoissa 10 µM TEB:tä vähensi solujen lisääntymistä ja liikkumista, lisäsi apoptoosia ja alensi proteaaseihin, hormoneihin, angiogeenisiin tekijöihin, kasvutekijöihin ja sytokiineihin liittyvän lähetti-RNA:n määriä (Zhou ym., 2016). Hamsterin munasarjakudoksessa 0,1 µM TEB:tä on raportoitu estäneen testosteronin ja estrogeenien tuotantoa (Kjærstad ym., 2010). Naudan keltarauhassoluissa 10 µM esti progesteronin synteesiä (Atmaca ym., 2018). Naudan kivessoluissa 1 µM:n pitoisuuden on raportoitu lisänneen testosteronin eritystä ja heikentäneen siittiöiden elinkykyä (Kabakci ym., 2021).
Tutkimuksessa käsitellään TEB:n akuuttia toksisuutta ja raportoituja hormonitoimintaan kohdistuvia vaikutuksia. Tehoaineen hyväksyntää kasvinsuojeluaineissa EU:ssa on jatkettu 31. heinäkuuta 2028 saakka komission täytäntöönpanoasetuksella (EU) 2026/1421. Rotilla raportoitu mediaaniletaaliannos (LD₅₀) oli 1 700 mg/kg (EFSA, 2015). Tarhamehiläisillä raportoidut mediaaniletaalipitoisuudet olivat 2 770 mg/L kahden päivän ja 1 840 mg/L neljän päivän altistuksen jälkeen. Kun pitoisuudet olivat 20–30 kertaa pienempiä, TEB vähensi aineenvaihduntaan, ruoansulatukseen ja vierasaineiden käsittelyyn osallistuvien entsyymien aktiivisuutta ja vaikutti immuunivasteeseen, kasvuun ja apoptoosiin liittyvien geenien ilmentymiseen (Cang ym., 2023).
Useissa tutkimuksissa on havaittu TEB-jäämiä kasveissa ja hedelmissä. Altistuminen omena-, päärynä-, kirsikka- ja persikkapuiden kukinnan aikana voi aiheuttaa riskin, sillä näiden puiden kukat tarjoavat tarhamehiläisille mettä ja siitepölyä (Fang ym., 2020; Li ym., 2020; Lucini & Molinari, 2009; Mohapatra, 2015; Szarka & Ramanarayanan, 2021). Aiemmissa tutkimuksissa altistuminen käsitellyillä kukilla tai saastuneen ravinnon välityksellä on yhdistetty akuuttiin myrkyllisyyteen tai toukkakuolleisuuteen (Fine ym., 2017; Yoder ym., 2017). Johnson ym. (2010) raportoivat suurempia TEB-jäämäpitoisuuksia tarhamehiläisissä ja pienempiä pitoisuuksia siitepölyssä ja hunajassa.
Kuhnurin siemennesteen laatu on ratkaiseva lisääntymiselle. Siittiöiden liikkuvuutta (MOT) käytetään yleisesti hedelmöityskyvyn arviointiin. Parittelun jälkeen siemenneste kerääntyy aluksi kuningattaren munanjohtimiin. Osa siittiöistä siirtyy siittiösäiliöön eli spermateekkaan. Muninnan aikana sieltä vapautuvat siittiöt voivat hedelmöittää munasoluja, joista voi kehittyä työläisiä. Siittiöiden liikkuvuus edistää sekä siittiöiden varastoitumista siittiösäiliöön että hedelmöitystä muninnan yhteydessä (Cobey ym., 2013). Solukalvon eheys (PMI) ja mitokondrion kalvopotentiaali (MMP) ovat myös tärkeitä siemennesteen laadun mittareita. PMI kertoo solun elinkyvystä solukalvon valikoivan läpäisevyyden perusteella. MMP kuvaa mitokondrioiden toimintaa, joka osallistuu solun ATP:n tuotantoon (Kaya & Uysal, 2023).Kuhnurin siemennesteen heikko laatu voi vaarantaa tarhamehiläisyhdyskunnan jatkuvuuden.
Ympäristön epäpuhtaudet voivat vaikuttaa siemennesteen laatuun. TEB:n haitallisia lisääntymisvaikutuksia oli raportoitu eri eläimillä ja ihmissolumalleissa, mutta vaikutukset kuhnurien siemennesteeseen olivat epäselviä (Kabakci ym., 2021; Taxvig ym., 2007; Yan ym., 2023; Zhou ym., 2016). Tutkimuksessa tarkasteltiin siksi in vitro, miten TEB:n pitoisuus ja altistusaika vaikuttivat kuhnurien siittiöiden MOT-, PMI- ja MMP-arvoihin.
Kuhnurit saatiin Kırıkkalen yliopiston mehiläistutkimuskeskuksesta. Siemenneste kerättiin touko- ja kesäkuussa, jolloin sukukypsiä kuhnureita on alueen mannerilmastossa eniten. Tutkijat käyttivät kuutta suunnilleen yhtä vahvaa yhdyskuntaa, joiden kuningattaret olivat samanikäisiä, ja keräsivät yhteensä 100 µL siemennestettä Schley-keinosiemennyslaitteella. TEB:tä testattiin pitoisuuksilla 0, 1, 10, 100 ja 1 000 µM lämpötilassa 33 °C. Siemennesteen laatua mitattiin alussa ja 24 tunnin inkubaation jälkeen (Cobey ym., 2013). Kaikki kokeet toistettiin vähintään kuusi kertaa.
Kun inkubaatio oli kestänyt 24 tuntia, suurin TEB-pitoisuus (1 000 µM) pienensi siittiöiden MOT-, PMI- ja MMP-arvoja tilastollisesti merkitsevästi (p < 0,05) muihin pitoisuuksiin verrattuna (kuva 4). Vaikutukset vaihtelivat pitoisuuden ja altistusajan mukaan. Pitoisuudella 1 000 µM MOT ja PMI olivat heikentyneet jo ensimmäisessä mittauksessa (kuva 1). Myös MMP pieneni 24 tunnin jälkeen (kuva 2).
Muissa in vitro- ja in vivo -tutkimuksissa on raportoitu triatsolifungisidien, kuten TEB:n, lisääntymisvaikutuksista eri lajeilla. Naudan kivessoluissa ja siemennesteessä 1 µM TEB:tä lisäsi Leydigin solujen testosteronituotantoa ja vähensi siittiöiden elinkykyä (Kabakci ym., 2021). Vaikutuksia havaittiin sonnin siemennesteessä pienemmällä pitoisuudella kuin kuhnurikokeessa. Siittiöiden rakenteen ja eliniän erot saattavat osaltaan selittää tätä. Kirjoittajien mainitsemissa säilytysoloissa kuhnurin siittiöt säilyivät huoneenlämmössä elinkykyisinä noin kuusi viikkoa ja sonnin siittiöt noin kaksi tai kolme päivää (Burley ym., 2008; De Pauw ym., 2003). Tiineiden rottien suun kautta saama TEB yhdistettiin koirasjälkeläisten feminisoitumiseen ja muutoksiin testosteronin ja progesteronin tuotannossa (Taxvig ym., 2007). Seeprakalalla TEB haittasi kivesten kehitystä ja vähensi siittiöiden liikkuvuutta (Yan ym., 2023).
Tarhamehiläiset voivat kenttäoloissa altistua useille torjunta-aineille, myös TEB:lle. Vaikutuksista yhdyskuntiin ja lisääntymiseen on vähän tutkimuksia.Eräässä kuhnureilla tehdyssä tutkimuksessa suun kautta saatu imidaklopridi, 200 ppb, vähensi siittiöiden liikkuvuutta ja vaikutti MMP:hen, kun taas PMI pysyi ennallaan (Ciereszko ym., 2017).Toisessa tutkimuksessa kasvatuksessa käytetyn mehiläisvahan amitratsi-, fluvalinaatti- ja kumafossijäämät vähensivät kuhnurien siittiöiden elinkykyä 5–20 % (Fisher & Rangel, 2018). Kairo ym. (2016) havaitsivat, että fiproniilialtistus pienensi kuhnurien siittiöiden PMI:tä ja ATP-pitoisuutta verrokkeihin verrattuna (Kairo ym., 2016). Vastaavasti kuhnurien altistus neonikotinoideille pienensi siittiöiden PMI:tä 20 % verrokkiryhmään verrattuna (Straub ym., 2021).
Torjunta-aineiden vaikutuksia kuhnurien siemennesteeseen on tutkittu in vitro vain vähän. Aiemmissa tutkimuksissa havaittiin muutoksia siittiöiden liikkuvuudessa, solukalvon eheydessä ja/tai ATP-pitoisuudessa tietyille torjunta-aineille altistumisen jälkeen (Abdelkader ym., 2015; Inouri-Iskounen ym., 2020).
Kirjoittajat kuvaavat työtään ensimmäiseksi in vitro -tutkimukseksi, jossa selvitettiin tebukonatsolin vaikutuksia kuhnurien siemennesteen laatuun. Pitoisuudella 1 000 µM MOT ja PMI pienenivät molemmissa mittauksissa ja MMP 24 tunnin jälkeen. Välillä 0–100 µM näissä mittareissa ei havaittu tilastollisesti merkitseviä eroja.Siittiöiden liikkuvuus on tärkeä lisääntymiskyvyn mittari. Liikkuvuus väheni molemmilla mittauskerroilla ryhmässä, joka altistui 1 000 µM:n TEB-pitoisuudelle. Solukalvon eheyden heikkeneminen voi vaurioittaa solua ja vähentää siittiöiden liikkuvuutta. Useissa tutkimuksissa on havaittu yhteys liikkuvuuden ja PMI:n välillä (Ahmad ym., 2014; Fraser ym., 2001; Varisli ym., 2009). Siittiöiden liike vaatii jatkuvaa energiansaantia. ATP antaa liikkeeseen tarvittavaa energiaa, ja mitokondriot osallistuvat sen tuotantoon (Abdelkader ym., 2015).MMP pieneni merkitsevästi, kun altistus 1 000 µM:n TEB-pitoisuudelle oli kestänyt 24 tuntia. Tämä saattoi osaltaan heikentää liikkuvuutta altistuksen lopussa. PMI:tä mitataan usein kuhnurin siittiöiden elinkyvyn arvioimiseksi (Kaya & Uysal, 2023). Altistus 1 000 µM:n TEB-pitoisuudelle pienensi PMI:tä in vitro. Kirjoittajat käsittelevät mahdollista vaikutusta solukalvoon. Sienissä TEB estää ergosterolin synteesiin osallistuvaa sytokromi P450 -entsyymiä ja vaikuttaa siten solukalvon eheyteen (Ito ym., 2013). Hajer ym. (2020) raportoivat rotilla kivesten P450:n ja glutationi-S-transferaasin aktiivisuuden estymistä, lisäkivestulehdusta ja siittiömäärän vähenemistä. Rotilla (Hajer ym., 2020) ja kanoilla (Serra ym., 2023) tehdyissä in vivo -tutkimuksissa raportoitiin enemmän siittiöiden poikkeavuuksia ja liikkuvuuden, nopeuden, määrän ja/tai elinkyvyn heikkenemistä.
Oksidatiivinen stressi on toinen mahdollinen selitys PMI:n pienenemiselle. Aiemmissa tutkimuksissa TEB-altistus on yhdistetty lipidien peroksidaatioon, proteiinien hapettumiseen ja DNA:n voimakkaaseen hajoamiseen urosten lisääntymiselimissä (Hajer ym., 2020).MMP on mitokondrioiden toiminnan mittari. Aiemmissa tutkimuksissa on osoitettu, että ympäristön torjunta-aineet voivat vaikuttaa siittiöiden ATP-pitoisuuksiin (Abdelkader ym., 2015; Kairo ym., 2016). Tässä kokeessa 1 000 µM TEB:tä pienensi MMP:tä 24 tunnin kohdalla. Kirjoittajat pohtivat pitkäaikaisen altistuksen tai kertymisen mahdollisia subletaaleja vaikutuksia pienemmillä pitoisuuksilla.
Sienitautien torjunta-aineiden jäämiä, mukaan lukien TEB, on havaittu ympäristössä, tarhamehiläisissä ja mehiläistuotteissa. Pitkäaikainen altistus pienille pitoisuuksille on erillinen kysymys. Hormonitoimintaan, aineenvaihduntaan tai koko elimistöön kohdistuvat vaikutukset riippuvat eliöstä, pitoisuudesta ja altistuksen kestosta (Johnson ym., 2010).
Johtopäätös Tutkimuksessa selvitettiin triatsolifungisidi TEB:n mahdollisia vaikutuksia kuhnurien siemennesteen laatuun in vitro. Solukalvon eheys ja mitokondrioiden toiminta edistävät siittiöiden elinkykyä ja liikkuvuutta. Havaitut muutokset antavat aiheen tutkia niiden mahdollisia vaikutuksia tarhamehiläisten lisääntymiseen sekä hunajan ja muiden mehiläistuotteiden tuotantoon kenttäoloissa.
Abdulkadir KAYA (Lisääntymisen ja keinosiemennyksen laitos, eläinlääketieteellinen tiedekunta, Kırıkkalen yliopisto, Kırıkkale, Türkiye; terveystieteiden instituutti, Ankaran yliopisto, Ankara, Türkiye) ja Ruhi KABAKÇI (Fysiologian laitos, eläinlääketieteellinen tiedekunta, Kırıkkalen yliopisto, Kırıkkale, Türkiye)
Turkish Veterinary Journal, 6(2), s. 71–77, 2024 · DOI 10.51755/turkvetj.1577784
Kommentit