Dilución del semen dializado y crioconservado tras la descongelación y fertilidad de las reinas de abeja melífera
Prefacio
La crioconservación del semen de los zánganos de la abeja melífera (Apis mellifera) sigue siendo un reto. Pese a décadas de investigación, conservar la viabilidad y la función de los espermatozoides tras la descongelación sigue limitando el uso práctico del semen congelado.
El estudio evaluó los efectos de diluir con Bee Semen Solution (BSS) el semen crioconservado de zánganos tras la descongelación. Las reinas se inseminaron instrumentalmente con semen fresco o crioconservado, diluido o sin diluir en ambos casos. Se midieron el número y la calidad de los espermatozoides almacenados en la espermateca y se evaluó el patrón de cría.
La crioconservación redujo la viabilidad de los espermatozoides y la fertilidad de las reinas con respecto al semen fresco. La dilución con BSS tras la descongelación mostró una tendencia a mejorar los parámetros espermáticos en la espermateca y la fertilidad. Los resultados sugieren que el manejo tras la descongelación, incluida la elección del diluyente, podría mejorar el resultado de la inseminación con semen crioconservado mediante un protocolo con diálisis. Los autores también proponen investigar si la inseminación repetida aumenta el número de espermatozoides en la espermateca y, con ello, la fertilidad de las reinas.
Introducción
La crioconservación y el almacenamiento del semen de zánganos plantean dificultades para la inseminación instrumental, la cría y la investigación. Pese a años de trabajo en protocolos eficaces (Melnichenko y Vavilov, 1975; Harbo, 1977; Kaftanoglu y Peng, 1984; Hopkins et al., 2012; Wegener et al., 2014a; Alçay et al., 2019), sigue sin haber un método de uso generalizado que preserve la capacidad fecundante durante el almacenamiento prolongado (Cobey, 2016; Smilga-Spalvina et al., 2023). Las dificultades abarcan la congelación, el almacenamiento y la inseminación eficaz con el material descongelado. La congelación y la descongelación pueden aumentar los defectos morfológicos, como cabezas deformadas y flagelos retorcidos (Yániz et al., 2024), y reducir la motilidad y la viabilidad de los espermatozoides (Hopkins y Herr, 2010; Özkök y Selcuk, 2020).
Diversos estudios han examinado los diluyentes empleados antes de la crioconservación y su efecto sobre la calidad del semen (Harbo, 1979; Taylor et al., 2009; Hopkins y Herr, 2010; Wegener et al., 2012; Alçay et al., 2019, 2022; Gulov y Laskin, 2021; Aktar et al., 2024; Nur et al., 2024; Mohammadi et al., 2025). Algunos crioprotectores de uso habitual pueden dañar a los espermatozoides, a las reinas o a ambos (Hopkins y Herr, 2010; Wegener y Bienefeld, 2012; Wegener et al., 2012). Diluir o retirar gran parte del crioprotector tras la descongelación podría reducir sus efectos tóxicos (Wegener et al., 2014a; Gül et al., 2017; Auth y Hopkins, 2021). Por ello se estudian diluyentes que estabilicen las membranas espermáticas tras la descongelación y reduzcan los daños. Pocos estudios han examinado cómo esta dilución afecta a la calidad de los espermatozoides en la espermateca y a la fertilidad de las reinas.
Wegener et al. (2014a) diluyeron el semen crioconservado con BSS y lo centrifugaron para eliminar el crioprotector y volver a concentrar los espermatozoides. La motilidad en la espermateca y la fertilidad de las reinas disminuyeron, y la cría de obreras representó el 27 % de la cría. Gül et al. (2017) lavaron y centrifugaron muestras con un diluyente, soluciones de glucosa o plasma seminal fresco de zánganos. No observaron un aumento significativo en la proporción de cría de obreras. En ambos estudios, la centrifugación tras la dilución pudo perjudicar la función de los espermatozoides y el éxito de la inseminación (Cobey et al., 2013). Wegener et al. (2014a) observaron mejores resultados de calidad espermática y fertilidad al diluir suavemente con BSS y mezclar a mano, sin centrifugación.
El procedimiento se aplicó solo a tres reinas. La proporción de una parte de semen por dos de BSS difería de la proporción 1:1 habitual en la inseminación de reinas (Skowronek et al., 1995; Gerula et al., 2016; Kahya y Gençer, 2022). Este estudio evaluó el efecto de diluir con BSS, tras la descongelación, semen dializado antes de congelarlo. Se midieron la fertilidad de las reinas y el número y la calidad de los espermatozoides en la espermateca.
Materiales y métodos (leer el artículo completo)
Resultados
En las muestras analizadas, la motilidad alcanzó el 98 % en el semen fresco y el 62 % en el descongelado. La mortalidad de las reinas no difirió significativamente entre los cuatro tratamientos (tabla 1). Una simulación de Montecarlo dio χ² = 1,14, gl = 3 y p = 0,77. Los análisis no paramétricos detectaron diferencias globales en las variables reproductivas y espermáticas evaluadas. La proporción de cría de obreras varió entre los grupos (Kruskal–Wallis H(3) = 28,13, p < 0,001).
Las reinas inseminadas con semen crioconservado (grupos 3 y 4) produjeron una proporción menor de cría de obreras que las inseminadas con semen fresco (grupos 1 y 2) (tabla 1). El tamaño del efecto de la crioconservación fue grande (δ de Cliff = 0,94–1,00). La diferencia entre los dos grupos de semen fresco no fue significativa (p = 1,000). En los grupos de semen crioconservado, la dilución con BSS se asoció con una mejora estimada pequeña a moderada (δ = −0,35 al comparar el grupo 3 con el 4), sin significación estadística.
El número de espermatozoides en la espermateca varió entre los tratamientos (p = 0,0005 según el artículo, tabla 2). Las reinas inseminadas con semen crioconservado almacenaron menos espermatozoides que las inseminadas con semen fresco (p < 0,05, δ = 0,72–1,00). Tras la descongelación, la dilución con BSS se asoció con una tendencia a recuentos más altos (δ = −0,30 al comparar el grupo 3 con el 4, p = 1,000, tabla S1). La motilidad también varió entre los tratamientos (H(3) = 25,60, p < 0,001) y disminuyó con la crioconservación (δ = 0,73–1,00). La motilidad fue mayor con la dilución en BSS que con semen descongelado sin diluir (δ = −0,52 al comparar el grupo 3 con el 4, p = 0,26). También hubo diferencias de viabilidad entre tratamientos (H(3) = 23,70, p < 0,001).
El semen crioconservado presentó una viabilidad considerablemente menor que el fresco (δ = 0,83–1,00). La diferencia estimada entre los dos grupos con semen descongelado fue mínima (δ = 0,03, p = 1,000, tabla S1).
Discusión
La crioconservación afectó al número y la calidad de los espermatozoides almacenados en la espermateca, como se ha descrito en estudios anteriores (Harbo, 1983; Kaftanoglu y Peng, 1984; Hopkins et al., 2012; Wegener et al., 2012, 2014a; Gül et al., 2017; Paillard et al., 2017; Gulov y Laskin, 2020, 2021; Yániz et al., 2020; Nur et al., 2024; Egyptien et al., 2025; Mohammadi et al., 2025). Pocos trabajos han evaluado la fertilidad de las reinas inseminadas con semen crioconservado, y difieren en los métodos de congelación y los diluyentes empleados antes o después de congelar. En la práctica, importa que la reina produzca suficientes obreras para sostener el crecimiento de la colonia (Bryła y Trzcińska, 2024), o suficientes huevos fecundados para criar nuevas reinas y conservar líneas genéticas para la selección (Wegener et al., 2012).
Las reinas inseminadas con semen crioconservado pueden poner huevos fecundados, aunque los resultados de fertilidad varían. Los primeros ensayos de inseminación única lograron la puesta con dosis de 3,3 µL o de volumen no especificado, respectivamente, pero registraron bajas proporciones de cría de obreras (8–22 % y 47 %) y recuentos bajos en la espermateca (0,1–0,2 millones de espermatozoides) (Harbo, 1983; Kaftanoglu y Peng, 1984). Los distintos diluyentes dieron resultados variables. Wegener et al. (2012) notificaron entre 0,7 y 1,3 millones de espermatozoides tras la crioconservación con dimetilsulfóxido (DMSO), frente a 2,4–3,6 millones con semen fresco. La adición del crioprotector mediante diálisis dio lugar a un 49–79 % de cría de obreras. Con la dilución suave tras descongelar, sin centrifugación, se obtuvo hasta un 65,8 % de cría de obreras y hasta 1,8 millones de espermatozoides en la espermateca (Wegener et al., 2014a).
Hopkins et al. (2012) observaron que las reinas inseminadas con 5 µL de semen crioconservado podían producir descendencia fértil durante varias generaciones. La fecundación alcanzó el 95–100 % en los mejores casos y promedió un 50 % al inicio y un 46 % en la primera generación. Estudios posteriores modificaron los protocolos de congelación e inseminación para mejorar la viabilidad de los espermatozoides tras la descongelación y la fertilidad de las reinas. Gül et al. (2017) observaron que las reinas inseminadas una vez con 5 µL de semen descongelado y lavado en plasma seminal de zángano produjeron proporciones de cría de obreras comparables a las del control con semen congelado (48 % y 47 %, respectivamente), con 0,81 y 1,6 millones de espermatozoides en la espermateca. No detectaron una mejora significativa. Algunos diluyentes alternativos utilizados antes de congelar, como las soluciones a base de miel, dieron resultados más prometedores.
Gulov y Laskin (2020, 2021) comunicaron que las reinas inseminadas una vez con 8–12 µL de semen crioconservado produjeron un 17–99 % de cría de obreras (media del 61 %) y almacenaron una media de 1,98 millones de espermatozoides en la espermateca. Nur et al. (2024) lograron la puesta con una sola inseminación de 8–10 µL con diluyentes sin crioprotectores, aunque no comunicaron datos de cría ni de espermatozoides. Una dilución excesiva redujo los recuentos en la espermateca a 0,14–0,15 millones, con o sin centrifugación (Paillard et al., 2017).
Con un protocolo sencillo de congelación sin antibióticos, Egyptien et al. (2025) obtuvieron huevos fecundados de una pequeña proporción de reinas inseminadas una vez con 5 µL de semen crioconservado. Esto demostró que el procedimiento era viable, aunque de eficacia limitada. En el presente estudio, la cría de obreras alcanzó un máximo del 90 % (media del 66 %) con semen descongelado sin diluir y del 95 % (media del 78 %) con semen descongelado diluido. Los recuentos medios en la espermateca fueron de 1,86 y 2,04 millones, respectivamente.
En conjunto, estos estudios muestran que el semen crioconservado permite la fecundación y la producción de obreras. Los resultados dependen del volumen inseminado, del manejo del semen, incluida la dilución o centrifugación, y del crioprotector o diluyente. En el presente estudio, las reinas se inseminaron dos veces, lo que podría explicar parte de las diferencias en el recuento de la espermateca frente a estudios anteriores. Woyke (1960), Mackensen (1964) y Bieńkowska et al. (2011) observaron que dividir una dosis en dos inseminaciones aumentaba el recuento en la espermateca frente a una sola inseminación.
Bolten y Harbo (1982) también observaron que dos inseminaciones con pequeñas cantidades de semen descongelado diluido aportaban a la espermateca significativamente más espermatozoides que una sola inseminación con el mismo volumen total. La segunda aportó entre un 68 y un 77 % más que la primera. Gąbka (2021) no detectó diferencias en el inicio de la puesta entre reinas inseminadas con distintas dosis. Las inseminaciones repetidas también pueden aumentar el riesgo de contaminación del semen y de infección de la reina (Gąbka, 2021; Smilga-Spalvina et al., 2023).
Por tanto, cabe investigar las inseminaciones repetidas como forma de aumentar el número de espermatozoides que
llegan a la espermateca, especialmente con semen crioconservado, ya que la congelación puede reducir su viabilidad y motilidad y afectar así al rendimiento reproductivo de la reina (Wegener et al., 2012; Yániz et al., 2024). Diluir el semen en un medio adecuado pudo influir en los resultados, aunque la dilución del semen fresco no mejoró significativamente los parámetros medidos. Ensayos anteriores con semen fresco hallaron escaso efecto de la dilución sobre el resultado de la inseminación (Mackensen, 1969; Skowronek et al., 1995; Lodesani et al., 2003; Gerula et al., 2016; Gąbka y Cobey, 2018; Kahya y Gençer, 2022). Con los diluyentes y las proporciones evaluados, esos estudios no hallaron diferencias significativas en el número de espermatozoides almacenados en la espermateca entre reinas que recibieron semen fresco diluido y sin diluir.La dilución tampoco produjo diferencias estadísticamente significativas entre los dos grupos que recibieron semen crioconservado. Los autores plantean que podría tener un efecto mayor tras la diálisis del semen frente a una solución crioprotectora hipertónica, como en este experimento. La diálisis extrae agua del semen, y la dilución tras la descongelación podría ayudar a restablecer su osmolaridad y viscosidad. Esto podría explicar los valores más altos observados con semen descongelado diluido al comparar medias, medianas y tamaños del efecto (delta de Cliff). La tendencia fue más evidente para la motilidad, el número de espermatozoides y la proporción de cría de obreras.
La trehalosa, un componente de la BSS (Wegener et al., 2014a), se encuentra de forma natural en el líquido seminal de los zánganos (Blum et al., 1962). Sus componentes, como proteínas, aminoácidos y azúcares, pueden ayudar a mantener la viabilidad de los espermatozoides durante el almacenamiento (den Boer et al., 2009). Nur et al. (2020) comunicaron que añadir 0,1 o 0,05 M de trehalosa a un medio de congelación con un 12 % de DMSO mejoró la motilidad y la integridad de la membrana plasmática tras la descongelación. Tsvetkov et al. (2024) observaron mayor motilidad y mejores parámetros cinéticos con trehalosa sin DMSO que con DMSO o glicerol. La BSS con trehalosa podría compensar en parte la pérdida de motilidad y favorecer la fecundación.
Muchos espermatozoides se pierden o dejan de ser viables al pasar por los oviductos hacia la espermateca. Tras el apareamiento natural, solo alrededor del 3–5 % llega a la espermateca (Yániz et al., 2020). Una pérdida adicional de espermatozoides móviles tras la crioconservación podría afectar a la fertilidad. Paillard et al. (2017) comunicaron un mayor riesgo de que no se produzca la puesta de huevos fecundados si llegan a la espermateca menos de 0,5 millones de espermatozoides. La dilución podría facilitar su dispersión.
La dilución también puede reducir la viscosidad del semen (Tofilski, 2014; Bratu y Pătruică, 2021). El semen es denso, tiende a formar grumos, sobre todo cuando se recoge de zánganos de mayor edad, y puede ser difícil de aspirar con una punta de inseminación estrecha (Cobey et al., 2013; Czekońska et al., 2013; Bieńkowska y Panasiuk, 2006). Diluirlo podría facilitar su administración durante la inseminación y el posterior desplazamiento de los espermatozoides por el tracto reproductor de la reina.
Se necesitan más estudios sobre la composición de los diluyentes y los protocolos de inseminación para mejorar la fertilidad de las reinas y hacer de la crioconservación del semen una herramienta práctica para la cría de abejas melíferas y la conservación genética.
Publicado en diciembre de 2025 · Journal of Apicultural Science · DOI 10.2478/JAS-2025-0013
Autores
Mikołaj Borański, Małgorzata Bieńkowska, Beata Panasiuk y Dariusz Gerula · The National Institute of Horticultural Research, Polonia
Jakob Wegener · GrüBie Ashiralieva&Wegener Gbr, Alemania
Traducción italiana de Davide Simeone
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