Verdünnung von dialysiertem, kryokonserviertem Drohnensperma nach dem Auftauen und Fruchtbarkeit von Honigbienenköniginnen
Vorwort
Die Kryokonservierung von Drohnensperma der Honigbiene (Apis mellifera) bleibt eine Herausforderung. Trotz jahrzehntelanger Forschung ist es weiterhin schwierig, die Lebensfähigkeit und Funktion der Spermien nach dem Auftauen zu erhalten. Das schränkt die praktische Nutzung tiefgefrorenen Spermas ein.
Die Studie untersuchte, wie sich die Verdünnung von kryokonserviertem Drohnensperma mit Bee Semen Solution (BSS) nach dem Auftauen auf die Lebensfähigkeit der Spermien und die Fortpflanzungsleistung der Königinnen auswirkt. Die Königinnen wurden instrumentell mit frischem oder kryokonserviertem Sperma besamt. Für beide Varianten gab es eine verdünnte und eine unverdünnte Gruppe. Die Forschenden erfassten Anzahl und Qualität der Spermien in der Spermatheka und untersuchten das Brutbild.
Die Kryokonservierung ging im Vergleich zu frischem Sperma mit einer geringeren Lebensfähigkeit der Spermien und einer niedrigeren Fruchtbarkeit der Königinnen einher. Nach der Verdünnung mit BSS zeigten die Messwerte in der Spermatheka und die Fruchtbarkeit eine Tendenz zur Verbesserung. Die Ergebnisse deuten darauf hin, dass die Behandlung nach dem Auftauen, einschließlich der Wahl des Verdünners, das Besamungsergebnis bei einem Kryokonservierungsverfahren mit Dialyse beeinflussen kann. Die Autoren schlagen außerdem vor, wiederholte Besamungen als Möglichkeit zu prüfen, die Spermienzahl in der Spermatheka und damit die Fruchtbarkeit der Königin zu erhöhen.
Einleitung
Die Kryokonservierung und Lagerung von Honigbienendrohnensperma sind weiterhin Herausforderungen für die instrumentelle Besamung, die Zucht und die Forschung. Trotz langjähriger Versuche zur Entwicklung wirksamer Verfahren (Melnichenko und Vavilov, 1975; Harbo, 1977; Kaftanoglu und Peng, 1984; Hopkins et al., 2012; Wegener et al., 2014a; Alçay et al., 2019) gibt es noch kein breit eingesetztes Verfahren, das die Befruchtungsfähigkeit nach Langzeitlagerung erhält (Cobey, 2016; Smilga-Spalvina et al., 2023). Schwierigkeiten betreffen das Einfrieren und Lagern der Proben sowie die erfolgreiche Besamung mit aufgetautem Material. Einfrieren und Auftauen können morphologische Defekte wie verformte Köpfe und verdrehte Geißeln häufiger machen (Yániz et al., 2024) und die Motilität und Lebensfähigkeit der Spermien verringern (Hopkins und Herr, 2010; Özkök und Selcuk, 2020).
Mehrere Studien untersuchten die vor der Kryokonservierung eingesetzten Verdünner und deren Einfluss auf die Spermaqualität (Harbo, 1979; Taylor et al., 2009; Hopkins und Herr, 2010; Wegener et al., 2012; Alçay et al., 2019, 2022; Gulov und Laskin, 2021; Aktar et al., 2024; Nur et al., 2024; Mohammadi et al., 2025). Manche häufig verwendeten Kryoprotektiva können Spermien, Königinnen oder beide schädigen (Hopkins und Herr, 2010; Wegener und Bienefeld, 2012; Wegener et al., 2012). Eine Verdünnung oder weitgehende Entfernung des Kryoprotektivums nach dem Auftauen könnte seine toxische Wirkung mindern (Wegener et al., 2014a; Gül et al., 2017; Auth und Hopkins, 2021). Deshalb werden alternative Verdünner untersucht, die nach dem Auftauen die Spermienmembranen stabilisieren und Schäden begrenzen. Zur Wirkung einer Verdünnung nach dem Auftauen auf die Spermienqualität in der Spermatheka und die Fruchtbarkeit der Königin gibt es bislang wenige Studien.
Wegener et al. (2014a) verdünnten kryokonserviertes Sperma mit BSS und zentrifugierten es anschließend, um das Kryoprotektivum zu entfernen und die Spermien wieder zu konzentrieren. Die Spermienmotilität in der Spermatheka und die Fruchtbarkeit der Königinnen sanken. Der Anteil der Arbeiterinnenbrut lag bei 27 %. Gül et al. (2017) wuschen und zentrifugierten Proben mit einem Spermaverdünner, Glukoselösungen oder frischem Seminalplasma von Drohnen. Der Anteil der Arbeiterinnenbrut nahm nicht signifikant zu. In beiden Studien könnte die Zentrifugation nach der Verdünnung die Funktion der Spermien und den Besamungserfolg beeinträchtigt haben (Cobey et al., 2013). Wegener et al. (2014a) berichteten über bessere Spermienqualität und Fruchtbarkeit, wenn sie die aufgetauten Proben vorsichtig mit BSS verdünnten und von Hand mischten, ohne sie zu zentrifugieren.
Dieses Verfahren wurde nur bei drei Königinnen angewandt. Das Mischungsverhältnis von einem Teil Sperma zu zwei Teilen BSS wich vom häufig verwendeten Verhältnis 1:1 ab (Skowronek et al., 1995; Gerula et al., 2016; Kahya und Gençer, 2022). Die vorliegende Studie untersuchte, wie die Verdünnung mit BSS nach dem Auftauen von vor dem Einfrieren dialysiertem Sperma die Fruchtbarkeit der Königinnen sowie Anzahl und Qualität der Spermien in der Spermatheka beeinflusst.
Material und Methoden (vollständigen Artikel lesen)
Ergebnisse
In den untersuchten Proben erreichte die Motilität bei frisch gewonnenem Sperma 98 % und bei aufgetautem Sperma 62 %. Die Sterblichkeit der Königinnen unterschied sich zwischen den vier Behandlungen nicht signifikant (Tabelle 1). Eine Monte-Carlo-Simulation ergab χ² = 1,14, df = 3 und p = 0,77. Nichtparametrische Analysen zeigten Unterschiede bei den untersuchten Fortpflanzungs- und Spermienmerkmalen. Der Anteil der Arbeiterinnenbrut unterschied sich zwischen den Gruppen (Kruskal–Wallis H(3) = 28,13, p < 0,001).
Königinnen, die mit kryokonserviertem Sperma besamt wurden (Gruppen 3 und 4), erzeugten anteilig weniger Arbeiterinnenbrut als Königinnen, die frisches Sperma erhielten (Gruppen 1 und 2) (Tabelle 1). Der Effekt der Kryokonservierung war groß (Cliffs δ = 0,94–1,00). Zwischen den beiden Gruppen mit frischem Sperma bestand kein signifikanter Unterschied (p = 1,000). In den kryokonservierten Gruppen ging die BSS-Verdünnung mit einem kleinen bis mittleren geschätzten Vorteil einher (δ = −0,35 für Gruppe 3 gegenüber Gruppe 4), der statistisch nicht signifikant war.
Die Spermienzahlen in der Spermatheka unterschieden sich zwischen den Behandlungen (berichteter p-Wert 0,0005, Tabelle 2). Mit kryokonserviertem Sperma besamte Königinnen speicherten weniger Spermien als mit frischem Sperma besamte Königinnen (p < 0,05, δ = 0,72–1,00). Eine Verdünnung mit BSS nach dem Auftauen ging tendenziell mit höheren Spermienzahlen einher (δ = −0,30 für Gruppe 3 gegenüber Gruppe 4, p = 1,000, Tabelle S1). Auch die Motilität variierte zwischen den Behandlungen (H(3) = 25,60, p < 0,001). Sie nahm durch die Kryokonservierung ab (δ = 0,73–1,00). Nach der Verdünnung mit BSS war sie höher als bei unverdünntem aufgetautem Sperma (δ = −0,52 für Gruppe 3 gegenüber Gruppe 4, p = 0,26). Auch die Lebensfähigkeit unterschied sich zwischen den Behandlungen (H(3) = 23,70, p < 0,001).
Die Lebensfähigkeit war bei kryokonserviertem Sperma deutlich geringer als bei frischem Sperma (δ = 0,83–1,00). Der geschätzte Unterschied zwischen den beiden Gruppen mit aufgetautem Sperma war vernachlässigbar (δ = 0,03, p = 1,000, Tabelle S1).
Diskussion
Die Kryokonservierung beeinflusste Anzahl und Qualität der in der Spermatheka gespeicherten Spermien, wie bereits in früheren Arbeiten beschrieben (Harbo, 1983; Kaftanoglu und Peng, 1984; Hopkins et al., 2012; Wegener et al., 2012, 2014a; Gül et al., 2017; Paillard et al., 2017; Gulov und Laskin, 2020, 2021; Yániz et al., 2020; Nur et al., 2024; Egyptien et al., 2025; Mohammadi et al., 2025). Vergleichsweise wenige Studien erfassten die Fruchtbarkeit von Königinnen nach Besamung mit kryokonserviertem Sperma. Sie unterscheiden sich in den Gefrierverfahren und den Verdünnern vor oder nach dem Einfrieren. Für die Praxis ist entscheidend, ob die Königin genug Arbeiterinnen für das Wachstum des Volkes erzeugt (Bryła und Trzcińska, 2024) oder zumindest genügend befruchtete Eier legt, um neue Königinnen aufzuziehen und Zuchtlinien zu erhalten (Wegener et al., 2012).
Mit kryokonserviertem Sperma besamte Königinnen können befruchtete Eier legen, die Ergebnisse schwanken jedoch. Frühere Versuche mit einmaliger Besamung ergaben eine Eiablage nach 3,3 µL beziehungsweise nicht angegebenen Mengen, aber geringe Anteile an Arbeiterinnenbrut (8–22 % bzw. 47 %) und niedrige Spermienzahlen (0,1–0,2 Millionen) in der Spermatheka (Harbo, 1983; Kaftanoglu und Peng, 1984). Verschiedene Verdünner lieferten unterschiedliche Ergebnisse. Nach Kryokonservierung mit Dimethylsulfoxid (DMSO) berichteten Wegener et al. (2012) über 0,7–1,3 Millionen Spermien gegenüber 2,4–3,6 Millionen bei frischem Sperma. Bei Zugabe des Kryoprotektivums durch Dialyse wurden 49–79 % Arbeiterinnenbrut erzielt. Durch vorsichtige Verdünnung nach dem Auftauen ohne Zentrifugation wurden bis zu 65,8 % Arbeiterinnenbrut und bis zu 1,8 Millionen Spermien in der Spermatheka erreicht (Wegener et al., 2014a).
Hopkins et al. (2012) zeigten, dass Königinnen nach Besamung mit 5 µL kryokonserviertem Sperma über mehrere Generationen fruchtbare Nachkommen erzeugen konnten. Die Befruchtungsrate lag in den besten Fällen bei 95–100 % und betrug anfangs durchschnittlich 50 % und in der ersten Nachkommengeneration 46 %. Spätere Studien passten die Gefrier- und Besamungsverfahren an, um die Lebensfähigkeit der Spermien nach dem Auftauen und die Fruchtbarkeit der Königinnen zu verbessern. Gül et al. (2017) berichteten, dass Königinnen nach einmaliger Besamung mit 5 µL aufgetautem, in Drohnenseminalplasma gewaschenem Sperma ähnlich viel Arbeiterinnenbrut erzeugten wie die Kontrollgruppe mit gefrorenem Sperma (48 % bzw. 47 %). In der Spermatheka wurden 0,81 bzw. 1,6 Millionen Spermien gezählt. Eine signifikante Verbesserung wurde nicht festgestellt. Einige alternative Verdünner vor dem Einfrieren, darunter Lösungen auf Honigbasis, ergaben günstigere Ergebnisse.
Gulov und Laskin (2020, 2021) berichteten, dass Königinnen nach einmaliger Besamung mit 8–12 µL kryokonserviertem Sperma 17–99 % Arbeiterinnenbrut erzeugten (Mittelwert 61 %) und durchschnittlich 1,98 Millionen Spermien in der Spermatheka speicherten. Nur et al. (2024) erzielten eine Eiablage nach einmaliger Besamung mit 8–10 µL unter Verwendung von Verdünnern ohne Kryoprotektivum. Daten zu Brut und Spermien wurden nicht angegeben. Übermäßige Verdünnung verringerte die Spermienzahl in der Spermatheka unabhängig von der Zentrifugation auf 0,14–0,15 Millionen (Paillard et al., 2017).
Mit einem einfachen Gefrierverfahren ohne Antibiotika erzielten Egyptien et al. (2025) bei einem kleinen Anteil der einmalig mit 5 µL kryokonserviertem Sperma besamten Königinnen befruchtete Eier. Das Verfahren war damit grundsätzlich machbar, seine Effizienz aber begrenzt. In der vorliegenden Studie lag der Anteil der Arbeiterinnenbrut mit unverdünntem aufgetautem Sperma bei bis zu 90 % (Mittelwert 66 %), mit verdünntem bei bis zu 95 % (Mittelwert 78 %). Die durchschnittlichen Spermienzahlen in der Spermatheka betrugen 1,86 bzw. 2,04 Millionen.
Zusammen zeigen die Studien, dass mit kryokonserviertem Sperma eine Befruchtung und die Aufzucht von Arbeiterinnen möglich sind. Die Ergebnisse hängen vom Besamungsvolumen, von der Behandlung des Spermas, etwa durch Verdünnung oder Zentrifugation, sowie vom Kryoprotektivum oder Verdünner ab. In der vorliegenden Studie wurden die Königinnen zweimal besamt, was einen Teil der Unterschiede zu früheren Studien erklären könnte. Woyke (1960), Mackensen (1964) und Bieńkowska et al. (2011) stellten fest, dass die Aufteilung einer Dosis auf zwei Besamungen die Spermienzahl in der Spermatheka gegenüber einer einmaligen Besamung erhöht.
Auch Bolten und Harbo (1982) stellten fest, dass nach zweimaliger Besamung mit kleinen Mengen verdünnten aufgetauten Spermas bei gleichem Gesamtvolumen signifikant mehr Spermien die Spermatheka erreichten als nach einmaliger Besamung. Bei der zweiten Besamung gelangten 68–77 % mehr Spermien in die Spermatheka als bei der ersten. Gąbka (2021) fand bei unterschiedlichen Spermadosen keinen Unterschied beim Beginn der Eiablage. Wiederholte Besamungen können außerdem das Risiko einer Kontamination des Spermas und einer Infektion der Königin erhöhen (Gąbka, 2021; Smilga-Spalvina et al., 2023).
Wiederholte Besamungen könnten daher als Möglichkeit untersucht werden, die Zahl der Spermien zu erhöhen, die
die Spermatheka erreichen. Das gilt besonders bei kryokonserviertem Sperma, da das Einfrieren die Lebensfähigkeit und Motilität der Spermien verringern und dadurch die Fortpflanzungsleistung der Königin beeinflussen kann (Wegener et al., 2012; Yániz et al., 2024). Die Verdünnung in einem geeigneten Medium könnte die Ergebnisse beeinflusst haben, obwohl die Verdünnung frischen Spermas die untersuchten Merkmale nicht signifikant verbesserte. Frühere Versuche mit frischem Sperma ergaben einen geringen Einfluss der Verdünnung auf den Besamungserfolg (Mackensen, 1969; Skowronek et al., 1995; Lodesani et al., 2003; Gerula et al., 2016; Gąbka und Cobey, 2018; Kahya und Gençer, 2022). Bei den untersuchten Verdünnern und Mischungsverhältnissen fanden diese Studien keine signifikanten Unterschiede in der Spermienzahl in der Spermatheka zwischen Königinnen, die verdünntes oder unverdünntes frisches Sperma erhielten.Auch zwischen den beiden Gruppen mit kryokonserviertem Sperma ergaben sich durch die Verdünnung keine statistisch signifikanten Unterschiede. Die Autoren halten einen größeren Einfluss für möglich, wenn das Sperma zuvor wie in diesem Versuch gegen eine hypertone Kryoprotektivumlösung dialysiert wurde. Die Dialyse entzieht dem Sperma Wasser. Die Verdünnung nach dem Auftauen könnte dazu beitragen, Osmolarität und Viskosität wiederherzustellen. Das könnte die höheren Werte erklären, die sich beim Vergleich von Mittelwerten, Medianen und Effektgrößen (Cliffs Delta) für verdünntes aufgetautes Sperma zeigten. Diese Tendenzen waren bei der Spermienmotilität, der Spermienzahl und dem Anteil der Arbeiterinnenbrut am deutlichsten.
Trehalose ist ein Bestandteil der BSS (Wegener et al., 2014a) und kommt natürlicherweise in der Samenflüssigkeit von Drohnen vor (Blum et al., 1962). Bestandteile dieser Flüssigkeit, darunter Proteine, Aminosäuren und Zucker, können die Lebensfähigkeit von Spermien bei der Lagerung unterstützen (den Boer et al., 2009). Nur et al. (2020) berichteten, dass 0,1 oder 0,05 M Trehalose in einem Gefriermedium mit 12 % DMSO nach dem Auftauen die Motilität und die Integrität der Plasmamembran verbesserten. Tsvetkov et al. (2024) fanden mit Trehalose ohne DMSO eine höhere Motilität und bessere Bewegungsparameter nach dem Auftauen als mit DMSO oder Glycerin. Trehalosehaltige BSS könnte den Rückgang der Motilität teilweise ausgleichen und so die Befruchtung unterstützen.
Auf dem Weg durch die Eileiter zur Spermatheka gehen viele Spermien verloren oder verlieren ihre Lebensfähigkeit. Nach natürlicher Paarung gelangen nur etwa 3–5 % in die Spermatheka (Yániz et al., 2020). Ein zusätzlicher Verlust beweglicher Spermien durch Kryokonservierung könnte sich daher auf die Fruchtbarkeit auswirken. Paillard et al. (2017) berichteten, dass Königinnen häufiger keine befruchteten Eier legen, wenn weniger als 0,5 Millionen Spermien die Spermatheka erreichen. Eine Verdünnung könnte die Verteilung der Spermien erleichtern.
Durch Verdünnung kann auch die Viskosität des Spermas sinken (Tofilski, 2014; Bratu und Pătruică, 2021). Sperma ist zähflüssig, neigt besonders bei älteren Drohnen zum Verklumpen und lässt sich mit einer engen Besamungsspitze schwer aufziehen (Cobey et al., 2013; Czekońska et al., 2013; Bieńkowska und Panasiuk, 2006). Die Verdünnung könnte die Verabreichung bei der Besamung und die anschließende Wanderung der Spermien im Fortpflanzungstrakt der Königin erleichtern.
Weitere Untersuchungen zur Zusammensetzung der Verdünner und zu Besamungsprotokollen sind nötig, um die Fruchtbarkeit der Königinnen zu verbessern und die Kryokonservierung von Sperma für die Honigbienenzucht und die Erhaltung genetischer Vielfalt nutzbar zu machen.
Veröffentlicht im Dezember 2025 · Journal of Apicultural Science · DOI 10.2478/JAS-2025-0013
Autoren
Mikołaj Borański, Małgorzata Bieńkowska, Beata Panasiuk und Dariusz Gerula · The National Institute of Horticultural Research, Polen
Jakob Wegener · GrüBie Ashiralieva&Wegener Gbr, Deutschland
Italienische Übersetzung von Davide Simeone
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