Spädning av dialyserad, kryokonserverad drönarsperma efter upptining och drottningarnas fertilitet
Förord
Kryokonservering av sperma från honungsbiets drönare (Apis mellifera) är fortfarande en utmaning. Trots årtionden av forskning begränsas den praktiska användningen av fryst sperma av svårigheten att bevara spermiernas livskraft och funktion efter upptining.
Studien undersökte hur spädning av kryokonserverad drönarsperma med Bee Semen Solution (BSS) efter upptining påverkade spermiernas livskraft och drottningarnas fortplantning. Drottningarna inseminerades instrumentellt med färsk eller kryokonserverad sperma. För båda typerna användes spädd och ospädd sperma. Forskarna mätte spermiernas antal och kvalitet i spermatekan och bedömde yngelmönstret.
Kryokonservering gav sämre livskraft hos spermierna och lägre fertilitet hos drottningarna än färsk sperma. Spädning med BSS efter upptining visade en tendens till bättre spermievärden i spermatekan och högre fertilitet. Resultaten tyder på att hanteringen efter upptining, däribland valet av spädningsmedel, kan påverka resultatet av insemination med sperma som kryokonserverats med en metod som innefattar dialys. Författarna föreslår också att upprepad insemination undersöks som ett sätt att öka antalet spermier i spermatekan och förbättra drottningarnas fertilitet.
Inledning
Kryokonservering och lagring av drönarsperma är fortfarande utmaningar för instrumentell insemination, avel och forskning. Trots mångårigt arbete med att utveckla effektiva metoder (Melnichenko och Vavilov, 1975; Harbo, 1977; Kaftanoglu och Peng, 1984; Hopkins et al., 2012; Wegener et al., 2014a; Alçay et al., 2019) finns ännu ingen allmänt använd metod som bevarar spermiernas befruktningsförmåga vid långtidslagring (Cobey, 2016; Smilga-Spalvina et al., 2023). Svårigheterna gäller både infrysning, lagring och framgångsrik insemination med upptinat material. Infrysning och upptining kan öka andelen morfologiska avvikelser, till exempel missbildade huvuden och vridna svansar (Yániz et al., 2024), samt försämra spermiernas rörlighet och livskraft (Hopkins och Herr, 2010; Özkök och Selcuk, 2020).
Flera studier har undersökt spädningsmedel som används före kryokonservering och deras inverkan på spermakvaliteten (Harbo, 1979; Taylor et al., 2009; Hopkins och Herr, 2010; Wegener et al., 2012; Alçay et al., 2019, 2022; Gulov och Laskin, 2021; Aktar et al., 2024; Nur et al., 2024; Mohammadi et al., 2025). Vissa vanliga kryoskyddsmedel kan skada spermier, drottningar eller båda (Hopkins och Herr, 2010; Wegener och Bienefeld, 2012; Wegener et al., 2012). Genom att späda ut eller avlägsna större delen av kryoskyddsmedlet efter upptining kan man eventuellt minska dess skadliga effekter (Wegener et al., 2014a; Gül et al., 2017; Auth och Hopkins, 2021). Därför undersöks spädningsmedel som stabiliserar spermiernas membran efter upptining och begränsar skadorna. Få studier har undersökt hur spädning efter upptining påverkar spermiernas kvalitet i spermatekan och drottningarnas fertilitet.
Wegener et al. (2014a) spädde kryokonserverad sperma med BSS och centrifugerade den för att avlägsna kryoskyddsmedlet och koncentrera spermierna igen. Spermiernas rörlighet i spermatekan och drottningarnas fertilitet minskade, och andelen arbetaryngel var 27 %. Gül et al. (2017) tvättade och centrifugerade spermaprover med ett spädningsmedel, glukoslösningar eller färsk seminalplasma från drönare. De fann ingen statistiskt signifikant ökning av andelen arbetaryngel. I båda studierna kan centrifugeringen efter spädning ha försämrat spermiernas funktion och inseminationsresultatet (Cobey et al., 2013). Wegener et al. (2014a) rapporterade bättre spermiekvalitet och fertilitet efter försiktig spädning med BSS och manuell blandning utan centrifugering.
Metoden prövades på bara tre drottningar. Blandningsförhållandet en del sperma till två delar BSS avvek från förhållandet 1:1 som ofta används vid insemination av drottningar (Skowronek et al., 1995; Gerula et al., 2016; Kahya och Gençer, 2022). Den aktuella studien undersökte hur spädning med BSS efter upptining av sperma som dialyserats före infrysningen påverkade drottningarnas fertilitet och spermiernas antal och kvalitet i spermatekan.
Material och metoder (läs hela artikeln)
Resultat
I de undersökta proverna var spermiernas rörlighet 98 % i färsk sperma och 62 % i upptinad sperma. Drottningarnas dödlighet skilde sig inte statistiskt signifikant mellan de fyra behandlingarna (tabell 1). En Monte Carlo-simulering gav χ² = 1,14, df = 3 och p = 0,77. Icke-parametriska analyser visade skillnader mellan grupperna i de undersökta fortplantnings- och spermieegenskaperna. Andelen arbetaryngel skilde sig mellan grupperna (Kruskal–Wallis H(3) = 28,13, p < 0,001).
Drottningar som inseminerades med kryokonserverad sperma (grupperna 3 och 4) producerade en lägre andel arbetaryngel än de som fick färsk sperma (grupperna 1 och 2) (tabell 1). Effekten av kryokonservering var stor (Cliffs δ = 0,94–1,00). Skillnaden mellan grupperna med färsk sperma var inte statistiskt signifikant (p = 1,000). Bland grupperna med kryokonserverad sperma var BSS-spädning förknippad med en liten till måttlig uppskattad förbättring (δ = −0,35 vid jämförelse mellan grupp 3 och grupp 4). Skillnaden var inte statistiskt signifikant.
Antalet spermier i spermatekan skilde sig mellan behandlingarna (rapporterat p = 0,0005, tabell 2). Drottningar som inseminerades med kryokonserverad sperma lagrade färre spermier än de som fick färsk sperma (p < 0,05, δ = 0,72–1,00). Spädning med BSS efter upptining visade en tendens till högre spermieantal (δ = −0,30 vid jämförelse mellan grupp 3 och grupp 4, p = 1,000, tabell S1). Spermiernas rörlighet varierade också mellan behandlingarna (H(3) = 25,60, p < 0,001) och minskade efter kryokonservering (δ = 0,73–1,00). Rörligheten var högre efter BSS-spädning än med ospädd upptinad sperma (δ = −0,52 vid jämförelse mellan grupp 3 och grupp 4, p = 0,26). Även livskraften varierade mellan behandlingarna (H(3) = 23,70, p < 0,001).
Spermiernas livskraft var betydligt lägre efter kryokonservering än i färsk sperma (δ = 0,83–1,00). Den uppskattade skillnaden i livskraft mellan de två grupperna med upptinad sperma var försumbar (δ = 0,03, p = 1,000, tabell S1).
Diskussion
Kryokonserveringen påverkade antalet spermier och deras kvalitet i spermatekan, vilket också rapporterats i tidigare studier (Harbo, 1983; Kaftanoglu och Peng, 1984; Hopkins et al., 2012; Wegener et al., 2012, 2014a; Gül et al., 2017; Paillard et al., 2017; Gulov och Laskin, 2020, 2021; Yániz et al., 2020; Nur et al., 2024; Egyptien et al., 2025; Mohammadi et al., 2025). Relativt få studier har mätt fertiliteten hos drottningar som inseminerats med kryokonserverad sperma. De skiljer sig åt i fråga om frysmetod och spädningsmedel före eller efter infrysning. I praktiken är det viktigt att drottningen producerar tillräckligt med arbetare för att bisamhället ska växa (Bryła och Trzcińska, 2024) eller tillräckligt med befruktade ägg för att föda upp nya drottningar och bevara genetiska linjer i aveln (Wegener et al., 2012).
Drottningar som insemineras med kryokonserverad sperma kan lägga befruktade ägg, men fertiliteten varierar. Tidiga försök med en enda insemination gav äggläggning efter 3,3 µL respektive en ej angiven volym, men andelen arbetaryngel var låg (8–22 % respektive 47 %) och antalet spermier i spermatekan var litet (0,1–0,2 miljoner) (Harbo, 1983; Kaftanoglu och Peng, 1984). Resultaten med olika spädningsmedel varierade. Wegener et al. (2012) rapporterade 0,7–1,3 miljoner spermier efter kryokonservering med dimetylsulfoxid (DMSO), jämfört med 2,4–3,6 miljoner med färsk sperma. Tillsats av kryoskyddsmedel genom dialys gav 49–79 % arbetaryngel. Försiktig spädning efter upptining utan centrifugering gav upp till 65,8 % arbetaryngel och upp till 1,8 miljoner spermier i spermatekan (Wegener et al., 2014a).
Hopkins et al. (2012) visade att drottningar som inseminerats med 5 µL kryokonserverad sperma kunde ge fertil avkomma under flera generationer. Befruktningsgraden nådde 95–100 % i de bästa fallen och var i genomsnitt 50 % inledningsvis och 46 % i första avkommegenerationen. Senare studier ändrade infrysnings- och inseminationsmetoderna för att förbättra spermiernas livskraft efter upptining och drottningarnas fertilitet. Gül et al. (2017) fann att drottningar som inseminerats en gång med 5 µL upptinad sperma tvättad i seminalplasma från drönare producerade ungefär samma andel arbetaryngel som kontrollgruppen med fryst sperma (48 % respektive 47 %). Antalet spermier i spermatekan var 0,81 respektive 1,6 miljoner. Förbättringen var inte statistiskt signifikant. Vissa alternativa spädningsmedel före infrysning, däribland honungsbaserade lösningar, gav mer lovande resultat.
Gulov och Laskin (2020, 2021) rapporterade att drottningar som inseminerats en gång med 8–12 µL kryokonserverad sperma producerade 17–99 % arbetaryngel (i genomsnitt 61 %) och lagrade i genomsnitt 1,98 miljoner spermier i spermatekan. Nur et al. (2024) fick drottningar att lägga ägg efter en enda insemination med 8–10 µL och spädningsmedel utan kryoskyddsmedel. De redovisade inga uppgifter om yngel eller spermier. Alltför kraftig spädning minskade antalet spermier i spermatekan till 0,14–0,15 miljoner, oavsett centrifugering (Paillard et al., 2017).
Med en enkel antibiotikafri infrysningsmetod fick Egyptien et al. (2025) befruktade ägg från en liten andel av de drottningar som inseminerats en gång med 5 µL kryokonserverad sperma. Metoden gick att använda men hade begränsad effektivitet. I den aktuella studien nådde andelen arbetaryngel upp till 90 % (i genomsnitt 66 %) med ospädd upptinad sperma och upp till 95 % (i genomsnitt 78 %) med spädd upptinad sperma. Antalet spermier i spermatekan var i genomsnitt 1,86 respektive 2,04 miljoner.
Studierna visar sammantaget att kryokonserverad sperma kan användas för befruktning och produktion av arbetare. Utfallet beror på inseminationsvolymen, hanteringen av sperman, till exempel spädning och centrifugering, samt valet av kryoskydds- eller spädningsmedel. I den aktuella studien inseminerades drottningarna två gånger, vilket delvis kan förklara skillnaderna i spermieantal jämfört med tidigare studier. Woyke (1960), Mackensen (1964) och Bieńkowska et al. (2011) fann att fler spermier nådde spermatekan när dosen delades upp på två inseminationer än när hela dosen gavs vid ett tillfälle.
Bolten och Harbo (1982) fann också att två inseminationer med små mängder spädd upptinad sperma gav signifikant fler spermier i spermatekan än en enda insemination med samma sammanlagda volym. Den andra inseminationen tillförde 68–77 % fler spermier än den första. Gąbka (2021) fann ingen skillnad i när äggläggningen började hos drottningar som fått olika doser. Upprepade inseminationer kan också öka risken för att sperman förorenas och drottningen får en infektion (Gąbka, 2021; Smilga-Spalvina et al., 2023).
Upprepad insemination kan därför vara värd att undersöka som ett sätt att öka antalet spermier som
når spermatekan, särskilt när kryokonserverad sperma används. Infrysning kan försämra spermiernas livskraft och rörlighet och därmed påverka drottningens fortplantning (Wegener et al., 2012; Yániz et al., 2024). Spädning i ett lämpligt medium kan ha påverkat resultaten, även om spädning av färsk sperma inte förbättrade de uppmätta egenskaperna signifikant. Tidigare försök med färsk sperma visade att spädningen hade liten inverkan på inseminationsresultatet (Mackensen, 1969; Skowronek et al., 1995; Lodesani et al., 2003; Gerula et al., 2016; Gąbka och Cobey, 2018; Kahya och Gençer, 2022). För de spädningsmedel och blandningsförhållanden som undersöktes fann studierna inga signifikanta skillnader i antalet spermier i spermatekan mellan drottningar som fick spädd eller ospädd färsk sperma.Spädning gav heller inga statistiskt signifikanta skillnader mellan de två grupperna med kryokonserverad sperma. Författarna menar att effekten kan vara större när sperman först dialyseras mot en hyperton lösning av kryoskyddsmedel, som i det här försöket. Dialysen drar ut vatten ur sperman. Spädning efter upptining kan bidra till att återställa osmolariteten och viskositeten. Det kan förklara de högre värdena för spädd upptinad sperma vid jämförelse av medelvärden, medianer och effektstorlekar (Cliffs delta). Tendensen var tydligast för spermiernas rörlighet, spermieantalet och andelen arbetaryngel.
Trehalos är en beståndsdel i BSS (Wegener et al., 2014a) och förekommer naturligt i drönarnas sädesvätska (Blum et al., 1962). Proteiner, aminosyror och sockerarter i vätskan kan bidra till att bevara spermiernas livskraft under lagring (den Boer et al., 2009). Nur et al. (2020) rapporterade att tillsats av 0,1 eller 0,05 M trehalos till ett frysmedium med 12 % DMSO förbättrade spermiernas rörlighet och plasmamembranets integritet efter upptining. Tsvetkov et al. (2024) fann högre rörlighet och bättre rörelseparametrar efter upptining med trehalos utan DMSO än med DMSO eller glycerol. BSS med trehalos kan delvis motverka minskad rörlighet och därmed bidra till befruktningen.
Många spermier försvinner eller förlorar sin livskraft på vägen genom äggledarna till spermatekan. Efter naturlig parning når bara omkring 3–5 % av spermierna spermatekan (Yániz et al., 2020). Ytterligare förlust av rörliga spermier efter kryokonservering kan därför påverka drottningens fertilitet. Paillard et al. (2017) rapporterade att risken för utebliven läggning av befruktade ägg ökade om färre än 0,5 miljoner spermier nådde spermatekan. Spädning kan underlätta spridningen av spermierna.
Spädning kan också minska spermans viskositet (Tofilski, 2014; Bratu och Pătruică, 2021). Sperma är trögflytande och tenderar att klumpa sig, särskilt när den samlas från äldre drönare. Den kan vara svår att dra upp i en smal inseminationsspets (Cobey et al., 2013; Czekońska et al., 2013; Bieńkowska och Panasiuk, 2006). Spädning kan göra det lättare att tillföra sperman vid inseminationen och underlätta spermiernas fortsatta förflyttning i drottningens fortplantningsorgan.
Fler studier av spädningsmedlens sammansättning och inseminationsmetoderna behövs för att förbättra drottningarnas fertilitet och göra kryokonservering till ett praktiskt verktyg för honungsbiavel och bevarande av genetisk mångfald.
Publicerad i december 2025 · Journal of Apicultural Science · DOI 10.2478/JAS-2025-0013
Författare
Mikołaj Borański, Małgorzata Bieńkowska, Beata Panasiuk och Dariusz Gerula · The National Institute of Horticultural Research, Polen
Jakob Wegener · GrüBie Ashiralieva&Wegener Gbr, Tyskland
Italiensk översättning av Davide Simeone
Kommentarer